Dans une étude récente publiée dans Neurosciences naturellesles chercheurs ont développé un nouveau protocole pour examiner les neurones dopaminergiques (DA) extraits de patients atteints de la maladie de Parkinson (MP) en utilisant le séquençage génomique unicellulaire.
Sommaire
Arrière-plan
Les études n’ont pas complètement élucidé les caractéristiques moléculaires des neurones DA dégénérés dans la substantia nigra pars compacta (SNpc), une caractéristique pathologique de la MP et de la démence à corps de Lewy (LBD). De plus, les chercheurs ont à peine évalué la cascade d’événements moléculaires qui conduisent à la perte de DA dans la MP, dont la compréhension est cruciale pour affiner les modèles de MP en laboratoire et aider au développement de thérapies spécifiques à la maladie.
La technologie de séquençage de l’acide ribonucléique unicellulaire (scRNA-seq) a permis le profilage et la visualisation du SNpc humain à une résolution unicellulaire. Cependant, la taille de l’échantillon de neurones DA échantillonnés est restée relativement petite, ce qui rend difficile l’identification des changements spécifiques au type de cellule.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont développé un nouveau protocole basé sur le tri des noyaux activés par fluorescence (FANS) pour enrichir sélectivement les noyaux de neurones DA à partir de SNpc humain post-mortem pour une utilisation dans le séquençage d’ARN à noyau unique (snRNA-seq). À l’aide de cette technologie de pointe, ils ont identifié dix populations de neurones DA distinctes sur le plan transcriptionnel.
Ensuite, les chercheurs ont utilisé une autre technologie de transcriptomique spatiale à haute résolution, slide-seq, pour localiser spatialement les dix populations distinctes de neurones DA le long de l’axe dorso-ventral du SNpc. En outre, ils ont effectué une analyse de regroupement de chaque espèce donneuse séparément pour attribuer des profils à l’une des sept principales classes de cellules, y compris les neurones DA. Ils ont utilisé des échantillons de tissus cérébraux congelés instantanément de rats, de souris et de macaques, y compris Macaca fascicularis, Tupaia belangeri, Rattus norvegicus et Mus musculus.
Les chercheurs ont microdisséqué le mésencéphale humain et le noyau caudé en cinq et 10 sections de 60 µm. Ensuite, un immunomarquage a été réalisé sur des coupes cryoconservées entre -15 et -20 °C. Pour récupérer les noyaux du groupe 2 (NR4A2) de la sous-famille 4 des récepteurs nucléaires dopaminergiques hautement fluorescents à 2,5–4,0%, l’équipe a utilisé un trieur de flux utilisant un protocole basé sur FANS. De même, ils ont effectué un snRNA-seq sur des noyaux NR4A2 négatifs ou 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI).
Résultats de l’étude
La présente étude a généré une taxonomie moléculaire remarquable des neurones SNpc DA humains. Les chercheurs ont généré 184 673 profils de premier ordre, avec 8 810 identifiants moléculaires uniques (UMI) en moyenne par donneur et 3 590 nombre médian de gènes par individu. Le nombre médian d’UMI par cellule était de 8 086 et le nombre médian de gènes par cellule était de 3 462, dont 43,6 % provenaient des cellules NR4A2 positives observées par cytométrie en flux.
Les auteurs ont observé un enrichissement des neurones DA de 70 fois dans les profils de noyaux triés par NR4A2 exprimant conjointement les gènes de la tyrosine hydroxylase (TH), du membre 3 de la famille des porteurs de solutés 6 (SLC6A3) et des gènes du membre 2 de la famille des porteurs de solutés 18 (SLC18A2). Notamment, les facteurs transcriptionnels (TF) codés par ces groupes de gènes sont essentiels à la neurotransmission DA.
De plus, les auteurs ont observé qu’une sous-population de DA, facteur de transcription SRY-box 6 (SOX6)-récepteur de type I de l’angiotensine II (AGTR1), était fortement enrichie en gènes associés à la MP. Des observations similaires ont été faites par des études antérieures d’association à l’échelle du génome (GWA), indiquant que le risque génétique associé à la MP influence préférentiellement la survie des neurones les plus vulnérables. Des études examinant les risques génétiques autosomiques dominants (AD) d’apparition tardive ont fait des observations similaires.
Les modifications transcriptionnelles au sein des cellules SOX_AGTR1 impliquaient plusieurs voies de stress cellulaire régulées par les TF codés par les gènes de la protéine tumorale p53 (TP53) et du membre 2 du groupe F de la sous-famille 2 des récepteurs nucléaires (NR2F2). Ces voies, par exemple les TF codés par NR2F2, favorisent le dysfonctionnement mitochondrial dans la MP. Par conséquent, ceux-ci semblaient critiques pour la mort neuronale associée à la MP.
Fait intéressant, les données snRNA-seq ont indiqué qu’un seul groupe de sous-population DA (sur 10), la calbindine 1 (CALB1)_GEM, était unique au macaque et à l’homme et absent chez la souris et le rat. Ils ont trouvé les cellules CALB1_GEM exclusivement dans le niveau dorsal du SNpc, qui est beaucoup plus étendu chez les primates mais pas chez les rongeurs. Par conséquent, les études utilisant des modèles de primates non humains (PNH) devraient vérifier si la population CALB1_GEM unique est responsable de la mise en place de projections atypiques des neurones du niveau dorsal des primates directement vers le cortex.
conclusion
Dans l’ensemble, les résultats de l’étude suggèrent que les mécanismes moléculaires spécifiques aux cellules jouent un rôle clé dans la vulnérabilité sélective de certaines populations de neurones DA à la dégénérescence de la MP. Ces résultats pourraient aider à guider les études transcriptomiques liées à la MP évaluant la localisation des signaux associés à la MP à des sous-types de DA humains spécifiques.
Poursuite du raffinement de in vitro Les protocoles de différenciation des neurones DA et les définitions des sous-types DA pourraient faciliter les dépistages génétiques de la vulnérabilité neuronale et les tests de médicaments thérapeutiques pour les troubles neurologiques tels que la MP.
