Le SRAS-CoV-2 détourne des facteurs antiviraux pour favoriser l'infection dans les cellules pulmonaires humaines

Le virus à l'origine de la pandémie actuelle de COVID-19, le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2), est connu pour se propager plus efficacement que les coronavirus pathogènes antérieurs, le SRAS-CoV et le MERS-CoV. Cependant, le taux de létalité jusqu'à présent a été beaucoup plus faible, de 2% à 5%, contre 10% dans le SRAS et ~ 40% dans le MERS. Les scientifiques pensent que le virus est inhibé par les interférons (IFN), encore plus que les virus précédents. En fait, les IFN sont actuellement utilisés pour réduire la gravité du COVID-19.

Maintenant, une nouvelle étude publiée dans le serveur de pré-impression bioRxiv * en août 2020 montre que dans des conditions proches de celles in vivo, Les IFN peuvent favoriser une invasion virale efficace à la place.

Cette image au microscope électronique à balayage montre le SRAS-CoV-2 (objets magenta ronds) émergeant de la surface de cellules cultivées en laboratoire. SARS-CoV-2, également connu sous le nom de 2019-nCoV, est le virus qui cause le COVID-19. Le virus montré a été isolé d'un patient aux États-Unis. Image capturée et colorisée au NIAID's Rocky Mountain Laboratories (RML) à Hamilton, Montana. Crédit: NIAID

Que sont les IFITM?

Les protéines transmembranaires induites par l'interféron (IFITM 1, 2 et 3) sont des protéines considérées comme inhibitrices de divers virus, y compris le SRAS-CoV. La plupart des preuves à ce sujet proviennent d'études qui ont utilisé des cellules surexprimant ces protéines et infectées par des pseudovirus.

Les chercheurs ont examiné les effecteurs immunitaires innés dirigés contre l'entrée du SRAS-CoV-2 dans les cellules cibles. L'entrée virale implique la reconnaissance médiée par des pics du récepteur de l'hôte, l'enzyme de conversion de l'angiotensine (ACE) 2, déclenchant un changement conformationnel irréversible de la protéine de pointe vers sa forme de fusion par clivage protéolytique en sous-unités S1 et S2. La protéine clivée fusionne avec la membrane plasmique et pénètre dans la cellule.

Les IFITM sont une famille de gènes stimulés par l'IFN (ISG) connus pour empêcher cette fusion, dans le cas des virus de la grippe A, des rhabdovirus et du VIH.

La surexpression de l'IFITM inhibe la liaison du pseudovirus S

Des travaux antérieurs ont montré que lorsque ces protéines sont exprimées à des niveaux excessivement élevés, les pseudoparticules exprimant la protéine de pointe du SRAS et du MERS sont incapables de pénétrer dans la cellule hôte. Le mécanisme d'inhibition pourrait réduire la rigidité et la courbure de la membrane plasmique de sorte que la fusion ne peut pas se produire. Alors que IFITM1 n'est que la membrane plasmique, IFITM2 et 3 sont localisés sur les membranes lysosomales à l'intérieur de la cellule. De nombreux scientifiques pensent que ces virus ne peuvent pas se répliquer dans les cellules où ces protéines sont exprimées.

Cependant, certaines études ont montré que les IFITM peuvent en fait augmenter l'intensité de l'infection par certains coronavirus humains. Dans le même temps, les IFITM mutants pourraient augmenter l'infection par de nombreux virus de cette famille, y compris le SRAS.

L'étude actuelle montre que la surexpression des IFITM réduit spécifiquement l'entrée des pseudoparticules à médiation par pic du SRAS-CoV-2, de deux ordres de grandeur pour IFITM2 et IFITM3 en particulier, et moins puissamment par IFITM1. L'infectivité de ces pseudovirus n'a pas été réduite, cependant, et en fait, elle a été légèrement augmentée dans un cas, car elle peut augmenter la vitesse à laquelle la protéine de pointe est intégrée dans le pseudovirus.

Les tests initiaux ont montré que les protéines de pointe SARS-CoV et SARS-CoV-2 exprimées dans les pseudovirus sont inhibées efficacement par les IFITM, la première encore plus que la seconde. Le mécanisme d'une telle inhibition semble se faire par ubiquitination et palmitoylation.

Dans tous les cas, ils ont constaté que les IFITM réduisent la fusion de cellule à cellule médiée par la liaison spike-ACE2. La déplétion de ces protéines a conduit à une augmentation de 3 à 7 fois de l'infection médiée par les pics par toutes les particules pseudovirales. Des tests supplémentaires dans une lignée cellulaire dépourvue d'expression d'IFITM ont montré que le nombre de foyers de liaison S-ACE2 a bondi vers le haut de quatre à dix fois. Ces découvertes impliquent fortement que les protéines IFITM sont des inhibiteurs efficaces de l'entrée virale médiée par le SRAS-CoV-2 S.

La question est de savoir si cette sensibilité à l'inhibition induite par l'IFITM de la liaison de S-ACE2 est partagée par le SRAS-CoV-2 même après son franchissement de la barrière des espèces pour infecter les hôtes humains.

Figure S1 (liée à la Figure 1). L'infection par VSVpp médiée par VSV-G n'est pas significativement inhibée par les protéines IFITM. (A) Quantification de VSV (luc) ΔG * VSV-G entrée par l'activité luciférase dans les cellules HEK293T exprimant de manière transitoire les protéines indiquées et infectées 24h après la transfection avec VSV (luc) ΔG * VSV-G (MOI 0,025) pendant 16 h. Les barres représentent les moyennes de n = 3 ± SEM. Panneau inférieur: Immunoblot des lysats de cellules entières (WCL) correspondants colorés avec anti-IFITM1, anti-IFITM2, anti-IFITM3, anti-PSGL-1, anti-ACE2 et anti-actine. (B) Analyse par immunoblot de cellules entières ou de lysats surnageants de cellules HEK293T transfectées de manière transitoire avec SARS-CoV-2 S VSVpp et des doses croissantes de construction d'expression IFITM1. Les transferts ont été colorés avec anti-Spike, anti-VSV-M, anti-IFITM1 et anti-actine. (C) Quantification de VSV (luc) ΔG * VSV-G particules par activité luciférase dans des cellules Caco-2 infectées avec le surnageant de cellules HEK293T transfectées de manière transitoire avec VSV-G et contrôle vide ou vecteurs d'expression IFITM. Les barres représentent les moyennes de n = 3 ± SEM. (D) Exemples d'immunoblots de lysats de cellules entières de cellules Calu-3 transfectées de manière transitoire avec des ARNsi de contrôle (si.NT) ou des ARNsi ciblant IFITM1, 2 ou 3 comme indiqué. Les pourcentages indiquent l'intensité du signal des trois protéines IFITM par rapport à ceux observés en présence de l'ARNsi de contrôle (100%).

IFITM réduit les charges virales

Les scientifiques ont découvert qu'en réponse aux interférons, les IFITM sont produits dans le poumon, qui est le principal site d'infection par le SRAS-CoV-2. Il est également induit dans d'autres tissus infectés. Les IFN ont des effets à la fois positifs et nocifs sur les tissus, et peuvent même aggraver la maladie et déclencher un COVID-19 sévère. Ils activent également une cascade de cytokines et chimiokines pro-inflammatoires, avec des effets encore inconnus sur la maladie.

L'expérience a été répétée en utilisant du SARS-CoV-2 authentique sur une lignée cellulaire exprimant le récepteur ACE2 seul ou avec des IFITM. Ils ont constaté que lorsque IFITM1 ou 2 était surexprimé, les charges d'ARN viral diminuaient considérablement de plus de 30 et 136 fois. Cependant, IFITM3 a produit une inhibition de cinq fois.

L'IFITM endogène améliore l'infection par le SRAS-CoV-2 sur les cellules Calu-3

IFITM2 ET 3 sont exprimés de manière constitutive à de faibles taux sur l'épithélium bronchique primaire du poumon humain, ainsi que sur les cellules Calu-3 qui expriment à la fois ACE2 et tous les IFITM. L'expression de tous les IFITM a été améliorée par un traitement avec des IFN, mais à des niveaux différents selon le type de cellule. L'IFN-β et l'IFN-γ étaient les plus efficaces pour augmenter l'IFITM1 et l'IFITM2 dans les cellules épithéliales bronchiques et l'IFITM1 dans les cellules Calu-3, respectivement, tandis que l'IFN-β était actif dans les organoïdes intestinaux.

Les chercheurs ont testé l'effet des IFITM sur la lignée cellulaire Calu-3. Ils ont découvert que lorsque le virus de type sauvage était utilisé pour infecter une lignée cellulaire pulmonaire humaine, Calu-3, l'expression endogène d'IFITM augmentait l'infection, avec et sans interféron. L'IFITM le plus important pour ce processus était l'IFITM2, qui a augmenté l'entrée et la production virales de plusieurs ordres de grandeur. Cependant, IFITMS n'a pas réussi à améliorer l'infection par le SRAS-CoV-2 dans les cellules HEK à différents niveaux d'expression.

Lorsque ces protéines endogènes ont été réduites au silence par le knock-down de siRNA, la réplication authentique du SARS-CoV-2 a pris un piqué raide, par 3-4 fois avec IFITM1 et IFITM3, et par 22 fois quand IFITM2 était absent. À 24 heures, IFITM2 a réduit la charge virale de plus de deux ordres de grandeur.

Ainsi, l'expression endogène des IFITM ne restreint pas mais augmente plutôt l'entrée et la réplication de ce virus dans les cellules pulmonaires humaines. Le traitement avec l'IFN-ß a provoqué une réduction de 22 fois des niveaux d'ARN viral à 48 heures de l'infection tout en faisant taire les IFITM les réduisait encore de 4 à 68 fois.

Le titre infectieux a été examiné par dosage de l'effet cytopathique (CPE) sur les cellules Vero. Cela a confirmé une baisse radicale du potentiel infectieux lors de la mise au silence de tous les IFITM. Si seulement IFITM1 ou IFITM3 était épuisé, le CPE était modeste et ne s'est produit qu'à de faibles dilutions. Avec l'épuisement de l'IFITM2, le CPE a été aboli, prouvant que l'absence de cette protéine réduisait le rendement en particules virales infectieuses de plus de quatre ordres de grandeur.

Implications et orientations futures

Ils ont conclu que les IFN amélioraient l'expression de base des protéines IFITM dans les cellules pulmonaires et d'autres tissus infectés par le SRAS-CoV-2, permettant la propagation virale in vivo. Les cellules Calu-3 sont donc un bon modèle pour étudier cette infection.

En d'autres termes, les chercheurs disent: «L'expression de l'IFITM est essentielle pour une réplication efficace du SARS-CoV-2 dans les cellules Calu-3. (Le virus utilise cette protéine) pour obtenir une réplication et une propagation efficaces dans des conditions physiologiques. » Cela peut également contribuer à un COVID-19 sévère puisque les facteurs antiviraux permettent au virus d'infecter efficacement les cellules des voies respiratoires inférieures.

Cette étude montre également combien il est essentiel de confirmer les observations d'effets antiviraux dans des conditions in vivo. Les chercheurs précédents peuvent avoir manqué l'effet d'amélioration car il est spécifique des IFITM affectés de manière endogène dans des cellules pulmonaires humaines infectées par le virus de type sauvage. Les anticorps contre ces protéines peuvent être une voie thérapeutique intéressante et nouvelle pour cette infection.

*Avis important

bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé ou être traités comme des informations établies.