Une équipe de recherche dirigée par le Dr Aixin YAN, professeur agrégé de la Division de recherche en biologie moléculaire et cellulaire, Faculté des sciences, en collaboration avec le professeur clinicien honoraire Patrick CY WOO du Département de microbiologie, Faculté de médecine Li Ka Shing, Université de Hong Kong (HKU), a signalé le développement d’une plate-forme transférable et intégrative basée sur CRISPR de type I qui peut éditer efficacement les divers isolats cliniques dePseudomonas aeruginosa, une superbactérie capable d’infecter divers tissus et organes et une source majeure d’infections nosocomiales.
La technique peut accélérer l’identification des déterminants de la résistance des agents pathogènes multirésistants (MDR) et le développement de nouvelles stratégies anti-résistance.
La recherche a ouvert une nouvelle voie pour modifier génomiquement ces espèces et isolats bactériens sauvages, tels que ceux ayant une importance clinique et environnementale et ceux formant le microbiome humain. Il a également fourni un cadre pour exploiter d’autres systèmes CRISPR-Cas répandus dans les génomes procaryotes et étendre les boîtes à outils basées sur CRISPR. La recherche a été publiée dans la principale revue scientifiqueRecherche sur les acides nucléiques.
Arrière-plan
Le système CRISPR-Cas comprend le système immunitaire adaptatif des procaryotes qui désarme les virus envahissants en clivant leur ADN. En raison de sa capacité unique de cibler et de modifier des séquences d’ADN, CRISPR-Cas a été exploité comme méthode d’édition du génome de nouvelle génération.
La méthode est basée sur le système CRISPR/Cas9 de classe 2 de type II, qui a révolutionné la génétique et la recherche biomédicale dans une pléthore d’organismes et a reçu le prix Nobel de chimie 2020. Cependant, les systèmes CRISPR-Cas de classe 2 ne représentent que ∼10% des systèmes CRISPR-Cas encodés naturellement chez les procaryotes. Leurs applications pour éditer des génomes bactériens sont plutôt limitées.
Remarquablement, les systèmes CRISPR-Cas appartenant à différentes classes et types sont continuellement identifiés, et ils servent de réservoir profond pour l’expansion des boîtes à outils basées sur CRISPR. Le système CRISPR-Cas le plus diversifié et le plus largement distribué est le système de type I qui représente 50 % de tous les systèmes CRISPR-Cas identifiés et a le potentiel d’étendre les boîtes à outils basées sur CRISPR avec des avantages distinctifs non accessibles avec les systèmes de classe 2, tels que comme une spécificité élevée, un hors-ciblage minimal et capable de délétions de grands fragments.
Cependant, le système CRISPR-Cas de type I repose sur un complexe effecteur à plusieurs composants appelé Cascade pour interférer avec l’ADN qui n’est pas facilement transférable à des hôtes hétérologues, ce qui entrave l’application généralisée de ces CRISPR naturellement abondants pour l’édition du génome et la thérapeutique.
Principales conclusions
Auparavant, l’équipe a identifié un système CRISPR-Cas de type IF hautement actif dans une clinique multirésistanteP. aeruginosasouche PA154197 qui a été isolée d’un cas d’infection sanguine à l’hôpital Queen Mary. Ils ont caractérisé ce système CRISPR-Cas et ont développé avec succès une méthode d’édition du génome applicable dans l’isolat MDR basée sur ce système IF CRISPR-Cas de type natif. La méthode a permis une identification rapide des déterminants de la résistance de l’isolat clinique MDR et le développement d’une nouvelle stratégie anti-résistance (Rapports de cellule, 2019, 29, 1707-1717).
Pour surmonter la barrière du transfert du complexe de type I Cascade à des hôtes hétérologues, dans cette étude, l’équipe a cloné l’intégralité du type IFcasopéron dans un vecteur mini-CTX capable d’intégration et a livré la cassette dans des hôtes hétérologues par conjugaison, une approche de transfert d’ADN courante dans la nature. Le vecteur mini-CTX a permis l’intégration de l’ensemble de la Cascade sur leattBlocus génétique dans le génome des hôtes hétérologues, leur permettant d’abriter un système IF CRISPR-Cas de type « natif » qui peut être exprimé et fonctionner de manière stable.
L’équipe a montré que le type transféré IF Cascade affiche une capacité d’interférence d’ADN significativement plus grande et une stabilité de souche plus élevée que le système Cas9 transférable et peut être utilisé pour l’édition du génome avec efficacité (> 80%) et simplicité, c’est-à-dire par une transformation en une étape de un seul plasmide d’édition.
De plus, ils ont développé un système transférable avancé qui comprend à la fois une cascade IF de type hautement active et une recombinase pour favoriser l’application du système dans des souches ayant une faible capacité de recombinaison homologue, sauvageP. aeruginosaisolats sans information sur la séquence du génome, et dans d’autresPseudomonasespèce.
Enfin, les gènes IF Cascade de type introduits peuvent être facilement retirés des génomes hôtes grâce à la délétion induite par IF Cascade de gros fragments d’ADN, ce qui entraîne une édition sans cicatrice du génome dans les cellules hôtes. L’application du système transférable pour la répression génique a également été démontrée, mettant en évidence les applications robustes et diverses du système transférable développé IF CRISPR.
Le Dr Aixin Yan a prédit que cette nouvelle méthode sera étendue à l’édition non seulement des agents pathogènes mais aussi du microbiome pour promouvoir la santé humaine.
Nous pensons que la technologie et les thérapies basées sur CRISPR apporteront de nouveaux espoirs dans la lutte contre les superbactéries à l’avenir. »
Dr Aixin YAN, Professeur agrégé, Division de recherche en biologie moléculaire et cellulaire, Faculté des sciences, Université de Hong Kong
