Dans la recherche d’antiviraux efficaces pour prévenir et traiter l’infection par le coronavirus 2 (SRAS-CoV-2) du syndrome respiratoire aigu sévère, les scientifiques ont étudié la possibilité d’inhiber la principale protéase virale (Mpro) et la protéase de type papaïne (PLpro), qui sont la clé de sa réplication. De nombreux composés qui inhibent ces enzymes ont été décrits et progressent dans la voie du développement de médicaments.
Cependant, une nouvelle étude, publiée le bioRxiv* en novembre 2020, attire l’attention sur la forte probabilité que ceux-ci n’aient pas d’activité anti-infectieuse en raison des voies redondantes présentes dans les cellules hôtes humaines.
Ces deux protéases sont des cystéine protéases, codées en tant que protéines non structurales (nsp) 3 et nsp 5. Parmi celles-ci, Mpro est autoclave à partir d’une grande polyprotéine puis dimérisée pour former la protéine fonctionnelle mature. Ils sont nécessaires pour cliver la grande polyprotéine virale en ses plusieurs parties fonctionnelles afin de permettre la mise en place du complexe de transcription-réplication à proximité des sites d’assemblage du virus dans les cellules hôtes infectées. Si l’un ou les deux sont inhibés, l’ARN viral est supprimé et l’infection ne peut pas être établie.
De nombreux inhibiteurs de Mpro ont été identifiés, y compris des composés covalents avec des ogives électrophiles, et l’un d’entre eux est entré dans des essais cliniques chez l’homme. Il n’en va pas de même pour le PLpro car il attache de préférence de grands substrats protéiques de type ubiquitine. Ainsi, les meilleurs inhibiteurs de PLpro semblent être ceux qui se lient aux sites non enzymatiques qui reconnaissent l’ubiquitine.
Sommaire
Problèmes avec les inhibiteurs Mpro / PLpro
Les inhibiteurs de protéase antérieurs ciblant d’autres virus à ARN ont été difficiles à développer, ce qui pourrait prédire des obstacles similaires sur le chemin de la tentative actuelle. D’une part, l’autoclivage initial de Mpro n’est pas facilement évité, étant donné le profil énergétique favorable de la réaction intramoléculaire.
Deuxièmement, le Mpro dimère est agrégé à des emplacements spécifiques dans le cytosol ou à la surface de la membrane près de la polyprotéine virale. Ainsi, les niveaux de substrat sont assez élevés à proximité de l’enzyme, ce qui rend une inhibition compétitive peu probable.
Troisièmement, de nombreuses protéases virales ont tendance à maintenir leurs produits de clivage liés dans les sites de clivage du substrat. Cela signifie qu’ils sont lents à se lier à l’inhibiteur à moins que le substrat clivé ne soit d’abord déplacé – appelé inhibition du produit. Et Mpro a un site actif où un inhibiteur ne peut agir qu’après la formation de son monomère, ce qui rend impossible d’éviter cette étape.
En bref, soulignent les scientifiques, les seuls inhibiteurs possibles sont ceux qui sont hautement biodisponibles et peuvent atteindre des concentrations locales suffisamment élevées pour inhiber de manière compétitive les substrats d’origine, et ainsi obtenir une inhibition précoce avant le début de la réplication active.
Réactivité croisée des inhibiteurs de protéase
Là encore, les inhibiteurs de protéase ont tendance à se lier à n’importe quelle protéase hôte avec une gamme de substrats préférés similaire. La redondance des voies enzymatiques dans la cellule hôte est un autre défi. Une gamme de systèmes cellulaires est utilisée pour étudier ces inhibiteurs de plomb, ce qui signifie qu’ils expriment diverses protéases à différents niveaux.
Par exemple, de nombreuses protéases peuvent accomplir le clivage de la protéine S de SARS-CoV-2 pour faciliter la fusion virale, y compris les cystéine cathepsines B et L et TMPRSS2. Tous ces éléments sont présents à des niveaux élevés sur les cellules pulmonaires, mais leur expression sur des lignées cellulaires expérimentales varie. Cela signifie que personne ne sait avec certitude quel type de cellule est en fait le reflet le plus précis du site d’infection primaire chez un hôte vivant, et qu’il ne sera peut-être pas possible de cibler l’un d’entre eux individuellement puisque les autres fournissent une voie d’évacuation.
Inhibiteurs Mpro désarmés par l’expression de TMPRSS2
Dans l’étude actuelle, les chercheurs ont sélectionné six composés covalents porteurs d’ogives électrophiles qui inhibaient le Mpro recombinant de manière dépendante du temps, sur environ 650 molécules qui ciblent les résidus cystéine dans Mpro et PLpro. Ils ont été incapables de trouver des pistes pour le développement d’inhibiteurs PLpro, peut-être en raison de la gamme très étroite de substrats appropriés.
Deux des six semblaient avoir une activité antivirale par inhibition de Mpro dans la lignée cellulaire modifiée d’adénocarcinome pulmonaire A549. Il existe une différence significative dans la puissance des tests d’infection cellulaire par rapport à in vitro tests, en raison de l’effet de l’absorption cellulaire et de la nécessité d’inhiber complètement Mpro dans la cellule hôte.
Cependant, lorsqu’ils sont testés dans des cellules exprimant TMPRSS2, leur puissance observée a fortement chuté. Le virus a réussi à pénétrer dans la cellule hôte via TMPRSS2, indiquant que le supposé inhibiteur de Mpro n’a en fait réussi qu’à inhiber la cathepsine. Cette activité a été confirmée.
Puissance des Mpro hits dans les tests d’infection cellulaire SARS-CoV-2. A) Deux des six inhibiteurs de Mpro nouvellement identifiés sont actifs dans le modèle d’infection A549 + ACE2. B) Courbes d’inhibition du SARS-CoV-2 du Remdesivir, E64d et K11777 dans les cellules A549 + ACE2 avec ou sans expression de TMPRSS2. C) courbes d’inhibition du SARS-CoV-2 des inhibiteurs de Mpro JCP400 et JCP403 dans les cellules A549 + ACE2 avec ou sans expression de TMPRSS2. Les données sont des moyennes ± écart-type de deux expériences répétées.
Ainsi, ces composés principaux ressemblent aux inhibiteurs connus de la cystéine cathepsine et de nombreux inhibiteurs de Mpro ont été signalés plus tôt, qui se sont également avérés être des inhibiteurs des cathepsines à des concentrations nanomolaires.
Quelles sont les implications?
Les chercheurs soulignent que bien que de nombreux inhibiteurs potentiels de Mpro et PLpro soient explorés pour le traitement de l’infection par le SRAS-CoV-2, il est important de s’assurer que ces composés sont effectivement sélectifs pour ces cibles enzymatiques, plutôt qu’inhibiteurs pour d’autres voies cellulaires redondantes. Par exemple, le rupintrivir, un inhibiteur supposé de la Mpro, est un inhibiteur de la cathepsine L très puissant, ce qui explique l’activité antivirale observée.
Deuxièmement, l’inhibition de la réplication virale n’est pas un substitut de l’inhibition sélective de l’enzyme cible, puisque la première peut également se produire par d’autres voies. Cette dernière doit être confirmée directement avant qu’une molécule principale puisse être considérée comme ayant l’efficacité souhaitée. La capacité à inhiber la catalyse d’un substrat de Mpro, ou à marquer l’enzyme Mpro active, est une métrique très récente pour évaluer l’activité Mpro au sein d’une cellule, en fait.
Troisièmement, les lignées cellulaires doivent être sélectionnées de manière appropriée pour tester l’activité antivirale afin de permettre l’identification des inhibiteurs qui agissent par des voies d’entrée virales redondantes.
Les auteurs résument: « Nous croyons fermement que nos résultats sont d’une importance particulière à la lumière des médicaments qui sont largement suggérés pour l’avancement dans les essais cliniques tels que le rupintrivir, ou même qui sont entrés dans des essais cliniques tels que K11777 et PF-07304814. »
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
