À l'intérieur de l'œil humain, la rétine est composée de plusieurs types de cellules, y compris les photorécepteurs de détection de lumière qui initient la cascade d'événements qui conduisent à la vision. Les dommages aux photorécepteurs, soit par une maladie dégénérative, soit par une blessure, entraîne une déficience visuelle permanente ou une cécité.
David Gamm, directeur du McPherson Eye Research Institute d'UW – Madison et professeur d'ophtalmologie et de sciences visuelles, a déclaré que la thérapie de remplacement des cellules souches utilisant des photorécepteurs cultivés en laboratoire est une stratégie prometteuse pour lutter contre les maladies rétiniennes. Le défi est que les traitements des cellules souches visant à remplacer les photorécepteurs doivent d'abord être testés chez les animaux. Étant donné que les cellules humaines ne sont pas compatibles chez d'autres espèces et sont rapidement rejetées lorsqu'elles sont transplantées, il est difficile d'évaluer leur potentiel.
Les rétines porcs et humaines partagent de nombreuses caractéristiques clés, ce qui rend les porcs idéaux pour modéliser les maladies rétiniennes humaines et tester la thérapeutique oculaire. En testant des photorécepteurs «équivalents humains» chez les porcs, nous pouvons avoir une meilleure idée de ce que ces cellules peuvent faire si elles ne sont pas immédiatement attaquées par l'animal hôte. «
David Gamm, directeur du McPherson Eye Research Institute de McPherson et professeur d'ophtalmologie et de sciences visuelles
Dans une nouvelle étude publiée dans Rapports de cellules souchesle laboratoire GAMM s'est associé à des chercheurs du Morgridge Institute for Research pour développer des organoïdes rétiniens de porcs cultivés en laboratoire. Ils ont constaté que les photorécepteurs dérivés du porc partageaient de nombreuses similitudes avec ceux fabriqués à partir d'organeïdes rétiniens humains.
« C'est la première fois que les gens fabriquent des organes rétiniens de porc », explique Kim Edwards, étudiante diplômée du laboratoire GAMM et premier auteur de l'étude. « Et c'était la première fois que les gens faisaient une comparaison de l'homme par rapport à une autre espèce d'organeïdes rétiniens. »
Les organoïdes sont de petits grappes de tissus – à peu près la taille d'une grande tête d'épingle – composée de centaines de milliers de cellules, qui permettent aux scientifiques de reproduire les interactions et conditions cellulaires dans un tissu ou un organe humain, mais dans l'environnement contrôlé d'un plat de laboratoire.
« Les cellules photorécepteurs au sein des organoïdes humains peuvent répondre à la lumière et communiquer entre elles par des connexions synaptiques », explique Gamm. « Pour déterminer s'ils peuvent se connecter à l'intérieur d'une rétine endommagée et restaurer la vision, nous devons transplanter et les tester chez les porcs. »
Edwards dit que pour obtenir des organoïdes de qualité, il est important de commencer avec des cellules souches de qualité. Ils ont collaboré avec le professeur adjoint adjoint de l'Université de Calgary, Li-Fang « Jack » Chu, anciennement post-doctorant du laboratoire de Jamie Thomson au Morgridge Institute, pour obtenir les cellules souches pluripotentes du porc.
« Historiquement, le laboratoire Thomson a été bon pour fabriquer des cellules souches pluripotentes induites par l'homme », explique Ron Stewart, chercheur de Morgridge en biologie informatique. « Mais il s'avère que les fabriquer pour des espèces supplémentaires comme Pig est vraiment difficile. Jack a travaillé et ouvre la voie avec son nouveau laboratoire. »
Après avoir réussi à générer des cellules souches pluripotentes induites par le porc, le prochain défi était de les encourager à se différencier en cellules rétiniennes. Edwards a commencé par utiliser le protocole organoïde humain établi du laboratoire GAMM pour voir si cela fonctionnerait à l'aide de cellules souches de Pig. Le moment du protocole était basé sur la période de gestation humaine de 40 semaines, mais ils ont noté que la grossesse d'un porc n'est qu'environ la moitié de cette longueur. Alors, les scientifiques pensaient, que se passe-t-il si nous utilisons le même protocole, mais que nous avons réduit le timing en deux?
« Nous avons pu en faire beaucoup d'organeïdes rétiniens, ce qui était vraiment excitant », explique Edwards. « C'est une bonne preuve de concept de montrer que si nous allons nous différencier en un type de cellule spécifique, nous devons vraiment prêter attention aux différences gestationnelles et aux différences inhérentes entre les cellules. »
En utilisant des techniques d'immunocytochimie, ils caractérisent les protéines associées à des cellules rétiniennes spécifiques présentes au niveau du développement à un stade précoce par rapport à un stade avancé dans les modèles organoïdes porc et humains. Pour creuser plus profondément, le laboratoire GAMM a collaboré avec le biologiste de calcul Beth Moore dans le groupe de biologie de calcul Stewart à Morgridge pour examiner l'expression des gènes dans les cellules en utilisant le séquençage d'ARN unique (RNA-Seq).
« Ils ont fait beaucoup de magie en utilisant un ARN-seq unique – des choses que nous ne pensions même pas être possibles », explique Edwards.
Les organoïdes sont dissociés en cellules individuelles et chaque cellule est marquée avec un code-barres et séquencé individuellement. Les données capturées sont ensuite utilisées pour regrouper des cellules similaires, donnant un aperçu approfondi de la nature de tous les types de cellules trouvés dans l'organoïde, y compris les photorécepteurs de tige et de cône et d'autres types de cellules tels que les cellules ganglionnaires rétiniennes.
« C'est une vision impartiale et très complète de ce que les gènes sont exprimés dans chaque type de cellule dans l'organoïde », explique Moore. « C'est un type de marqueur différent de l'immunochimie. C'est une façon différente de parvenir à la même conclusion de l'identification de différents types de cellules. »
Edwards et Moore ont dû surmonter les défis pour arriver à ces conclusions. Premièrement, étant donné la nature des organoïdes, Edwards avait besoin d'optimiser leurs protocoles pour séparer les cellules et les maintenir avant le séquençage.
« Ils n'aiment pas être dissociés et mettre un plat, en particulier les photorécepteurs », explique Edwards. « Nous plaisantons que les photorécepteurs fonctionnent mieux ensemble, tout comme les gens. »
Du côté de l'analyse des données, Moore explique que chaque cellule est encapsulée dans une gouttelette qui contient le code-barres pour le séquençage. Mais parfois, une gouttelette résume plusieurs cellules, ou la gouttelette peut être vide et ne contenir aucune cellule, qui introduit des erreurs dans les données de séquençage.
« Cela peut vraiment gâcher votre analyse, surtout lorsque vous essayez d'identifier différents types de cellules », explique Moore. Moore a développé un pipeline d'analyse pour filtrer toutes les séquences indésirables et normaliser les données. Elle a ensuite cartographié les gènes exprimés en différents grappes, qu'ils pourraient mapper à des types de cellules spécifiques et se comparer avec les résultats de l'immunocytochimie.
Un autre défi – la différence significative entre les génomes porc et humain – signifiait que Moore a également dû travailler sur une liste de gènes connus dans les deux espèces et les faire correspondre avec les séquences pour cartographier les différents types de cellules.
« Avoir ces données confirmatoires de Beth était vraiment critique pour nous de nous sentir confiants à ce que nous voyions », explique Edwards.
Ce travail a été soutenu par une subvention du Département américain de la défense en collaboration avec le National Eye Institute dans le but d'explorer la thérapie de remplacement des cellules pour traiter les blessures rétiniennes qui se produisent couramment dans l'armée. Les chercheurs ont commencé à effectuer des greffes chez les porcs à l'aide de photorécepteurs des organoïdes porcs pour déterminer s'ils établissent des connexions et établissent des synapses avec des neurones en aval.
« Nous sommes ravis de montrer que vous pouvez cultiver ces organes rétiniens à partir de différentes espèces et que de nombreux groupes à travers le monde commencent à les fabriquer », explique Edwards. « Tout commence par avoir de bonnes cellules souches. »
