Dans une étude récente publiée dans Biotechnologie naturelle, un groupe de chercheurs a introduit une méthode sensible et non invasive pour surveiller l’expression des gènes dans le cerveau à l’aide de rapporteurs techniques appelés marqueurs d’activité libérés (RMA), qui peuvent sortir du cerveau dans le sang pour une détection facile.
Arrière-plan
La surveillance de l’expression des gènes dans le cerveau vivant est cruciale pour comprendre la fonction cérébrale, le comportement et les maladies neurologiques. Les méthodes traditionnelles sont confrontées à des défis en raison de la structure complexe du cerveau, nécessitant des techniques non invasives mais sensibles et spécifiques. Il existe diverses méthodes, telles que l’imagerie par résonance magnétique (IRM), l’imagerie par ultrasons et les systèmes optiques, qui présentent des limites telles qu’une faible sensibilité et des difficultés d’imagerie des régions profondes du cerveau ou une limitation du multiplexage.
La plupart des études dépendent d’une analyse post mortem, qui n’est pas capable de suivre les changements au fil du temps chez le même animal. Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour optimiser et valider l’utilisation des RMA dans différentes régions et conditions du cerveau, garantissant ainsi leur large applicabilité et leur fiabilité dans divers contextes de recherche neurologique.
À propos de l’étude
Des chercheurs de l’Université Rice ont mené différentes études sur des souris avec un protocole approuvé par le comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux dans le cadre de plusieurs expériences. Ces expériences ont été réalisées sur des souris mâles et femelles de différentes souches, achetées auprès du laboratoire Jackson et conservées dans des conditions contrôlées.
La première phase impliquait la construction d’un plasmide. Les chercheurs ont utilisé un vecteur spécifique et exécuté plusieurs procédures, notamment la digestion, l’isolement, l’amplification et l’extraction de l’acide désoxyribonucléique (ADN). Ils se sont concentrés sur la création de diverses constructions en insérant différentes séquences dans le squelette plasmidique. Ces constructions comprenaient le virus adéno-associé-synapsine humaine-ribosomal mutant A (AAV-hSyn-RMA), avec différentes variantes, l’AAV-Glial Fibrillary Acidic (Gfa)-RMA, la protéine AAV-Fos (Fos)-RMA et d’autres, chacun servant un objectif unique dans la recherche.
Pour les expériences de culture cellulaire, la lignée cellulaire de phéochromocytome 12 (PC-12) a été utilisée. Ceux-ci ont été cultivés dans des environnements contrôlés et ensuite soumis à un test de luciférase in vitro. De même, des astrocytes dérivés du cortex de rat ont été cultivés et transfectés pour procéder aux tests. Dans les deux scénarios, la bioluminescence produite par les cellules transfectées a été soigneusement enregistrée.
Les chercheurs ont également mené des expériences sur la purification des protéines, en utilisant des cellules d’Escherichia coli pour transformer et exprimer les protéines RMA. Ces protéines ont ensuite été soumises à divers processus, notamment la centrifugation, la lyse et l’élution, pour atteindre la pureté souhaitée en vue d’une utilisation ultérieure.
Une partie essentielle de l’étude impliquait la production de vecteurs AAV. Ceux-ci ont été créés en transfectant des cellules du rein embryonnaire humain 293 avec des cellules à grand antigène T SV40 (HEK293T) avec divers plasmides, puis en récoltant et en purifiant le virus à l’aide d’une série de procédures complexes.
Des injections stéréotaxiques ont été réalisées sur des souris pour introduire des protéines ou des AAV dans des régions spécifiques du cerveau. Le processus d’injection a été soigneusement réalisé en utilisant des coordonnées précises et des conditions contrôlées.
Diverses méthodes ont été utilisées pour évaluer les effets des substances introduites. Celles-ci comprenaient des prises de sang pour les dosages de luciférase, la demi-vie sérique des protéines RMA et l’administration de produits chimiques. En outre, une imagerie histologique et une analyse du cerveau de souris ont été réalisées pour étudier les modèles de distribution ainsi que les effets provoqués par les substances injectées.
Enfin, les chercheurs ont appliqué l’analyse statistique à leur interprétation des données. Cela impliquait plusieurs tests pour comparer des ensembles de données et déterminer la signification de leurs résultats. Les résultats ont été soigneusement documentés et les figures ont été construites à l’aide d’Adobe Illustrator, illustrant la nature exhaustive de l’étude.
Résultats de l’étude
Dans l’étude, les chercheurs ont mené plusieurs expériences pour évaluer l’efficacité des RMA dans la détection de l’expression des gènes dans le cerveau. Initialement, les RMA ont été testés pour leur capacité à traverser la barrière hémato-encéphalique (BBB). Cela a été réalisé en injectant des protéines RMA dans le putamen caudé du cerveau de souris et en déterminant la concentration plasmatique.
Les résultats ont indiqué une augmentation significative de la concentration plasmatique de Gaussia luciférase (Gluc) -RMA, une variante de la RMA, ce qui suggère que le transport de la RMA du cerveau vers le sang s’est produit via un mécanisme dépendant du fragment cristallisable (Fc). De plus, les taux plasmatiques de Gluc-RMA n’ont diminué que légèrement au fil du temps, alors que les contrôles ont démontré une réduction prononcée, ce qui suggère que la demi-vie de ce biomarqueur est de plusieurs heures et lui permet ainsi de s’accumuler dans le sang.
L’étude a ensuite exploré les in vivo détection de l’expression des gènes cérébraux à l’aide des RMA. Les chercheurs ont injecté de l’AAV codant à la fois pour le Gluc-RMA et la protéine fluorescente verte (GFP) sous le promoteur hSyn dans le cerveau de la souris. Ils ont observé une augmentation substantielle du signal dans le plasma, indiquant la capacité des RMA à détecter l’expression des gènes. in vivo. Les expériences ont été menées dans diverses régions du cerveau comme le putamen caudé, Cornu Ammonis 1 (CA1) et la substance noire.
Les résultats ont montré des signaux plus de 20 000 fois plus élevés par rapport à la valeur initiale dans les trois régions. De plus, les niveaux de signal ont persisté jusqu’à la troisième semaine, probablement en raison du fait que le Gluc-RMA plasmatique a atteint un état d’équilibre. L’étude a également indiqué que Gluc-RMA détecte de manière fiable environ 0,001 % des neurones du cerveau de la souris.
En évaluant les niveaux d’expression sûrs des RMA, l’étude s’est concentrée sur l’identification des niveaux d’expression qui maximisent les bénéfices tout en minimisant les effets secondaires, en particulier les réponses immunitaires. Gluc-RMA a été exprimé dans le putamen caudé gauche sous le promoteur hSyn avec différentes doses d’AAV. Les résultats ont montré des signaux plasmatiques RMA significatifs pour toutes les doses sans perte neuronale significative, ce qui suggère que les effets indésirables potentiels de Gluc-RMA n’étaient pas suffisants pour provoquer la mort neuronale, même à la dose la plus élevée.
Les chercheurs ont également surveillé l’expression génétique spécifique à un type de cellule cérébrale. Ils ont administré du Gluc-RMA double floxé contrôlé par hSyn à des souris Tyrosine Hydroxylase-Cre (Th-Cre), qui expriment Cre dans les neurones dopaminergiques. L’étude a révélé des expressions spécifiques de Gluc-RMA et de GFP dans des cellules Th-positives au site d’injection local, démontrant la capacité de Gluc-RMA à détecter l’expression des gènes cérébraux dans de petites populations de cellules neuronales et d’une manière spécifique au type de cellule.
En outre, la capacité des RMA à suivre les changements dans l’expression du gène précoce immédiat Fos, qui s’exprime rapidement lors d’un stimulus cellulaire ou d’une activité neuronale, a été étudiée. Un modèle in vitro utilisant des cellules PC-12 transfectées avec Gluc-RMA contrôlées sous le promoteur Fos a été utilisé.
Les résultats ont montré une expression accrue de Gluc-RMA et de Fos lors de l’induction du facteur de croissance nerveuse, le signal de luminescence du milieu de culture augmentant de manière significative dans les six heures suivant l’exposition, ce qui suggère que Gluc-RMA peut générer un signal distinct en réponse aux changements du promoteur. activité.
Enfin, l’étude a exploré les RMA pour la mesure non invasive de l’activité neuronale. Une stratégie double conditionnelle a été utilisée, liant l’expression de Gluc-RMA à l’activité neuronale. L’étude a démontré des mesures ratiométriques multiplexées des RMA et leur capacité à rendre compte de l’activité neuronale in vivo dans des régions spécifiques du cerveau. De plus, Gluc-RMA a été utilisé pour améliorer l’imagerie par bioluminescence (BLI), montrant une intensité de signal améliorée et une corrélation avec les niveaux d’expression des gènes.
