Perturbation des gènes de la levure Pichia pastori pour augmenter sa production sécrétoire de protéines utiles

Une collaboration comprenant des chercheurs de l’Université de Kobe, de l’Université de Tokyo et de l’Université de Tohoku a réussi à identifier et à perturber des gènes dans la levure Pichia pastoris (1) afin d’augmenter sa production sécrétoire de protéines utiles (2).

Grâce à une série de processus qui impliquaient de combiner des perturbations génétiques, puis de cultiver en série (3) les multiples souches de perturbation résultantes, ils ont développé P. pastoris souches qui peuvent produire des rendements élevés de protéines utiles. On espère que cette découverte mènera au développement de techniques pour améliorer la production de protéines pour les anticorps biomédicaux et les enzymes industrielles, entre autres applications.

De l’Université de Kobe, la collaboration de recherche comprenait le professeur associé du projet ITO Yoichiro et le professeur associé ISHII Jun (tous deux du centre de recherche en biologie de l’ingénierie) et le professeur KONDO Akihiko (École supérieure des sciences, de la technologie et de l’innovation).

Ces résultats ont été publiés dans Biologie des communications le 8 juin 2022.

Points principaux

• Les chercheurs ont utilisé un test à haut débit formaté à plusieurs puits pour identifier P. pastoris perturbations génétiques qui pourraient augmenter la production sécrétoire de protéines utiles.
• La production sécrétoire de protéines utiles pourrait être augmentée lorsque de multiples perturbations des gènes identifiés étaient combinées.
• Ces gènes avec de multiples perturbations se sont avérés augmenter la production sécrétoire, même lorsque la protéine utile ou son expression étaient différentes.
• En cultivant ces souches de perturbation de plusieurs gènes (c’est-à-dire des souches de production de protéines utiles), les chercheurs ont réussi à augmenter la production sécrétoire de protéines utiles.

Fond de recherche

Ces dernières années, des tentatives ont été faites dans le monde entier pour produire des protéines pour des enzymes (utilisées dans l’industrie) et des anticorps (utilisés en biomédecine) via la production sécrétoire par la levure. P. pastoris (syn. Komagataella phaffii). Cependant, diverses difficultés entravent ce processus, par exemple, P. pastoris a un faible taux de production pour certaines protéines cibles.

À la lumière de cela, les chercheurs ont proposé l’approche suivante (Figure 1) visant à une productivité élevée des protéines difficiles à sécréter (ou des protéines à faible production sécrétoire) dans P. pastoris: 1. Identifiez les perturbations géniques efficaces en criblant une bibliothèque de souches aléatoires de perturbation du génome, 2. Ajoutez plusieurs perturbations aux gènes identifiés, 3. Améliorez la production sécrétoire grâce à la culture en série.

Méthodologie de recherche

Création d’une banque de perturbations génomiques aléatoires et criblage :

Afin de trouver des perturbations géniques efficaces dans une bibliothèque de perturbations génomiques aléatoires, les chercheurs ont tout d’abord développé une méthode simple pour évaluer dans quelle mesure diverses souches génétiquement modifiées pouvaient produire les protéines cibles (Figure 2).

L’anticorps anti-lysozyme single-chain variable fragment (scFv) (5) est difficile à sécréter dans P. pastoris. En utilisant scFv comme protéine modèle, les chercheurs ont mis en place un système de criblage multipuits à haut débit afin de pouvoir facilement évaluer la sécrétion de scFv par un grand nombre de souches mutantes.

Ils ont créé une bibliothèque aléatoire de perturbation du génome à partir de P. pastoris souches capables de produire du scFv, et en utilisant la méthode expliquée ci-dessus, ils ont pu évaluer la productivité du scFv de plus de 19 000 souches différentes. À partir de là, ils ont réussi à identifier six gènes dans lesquels la perturbation génique pourrait augmenter la production de scFv (cinq des six types de perturbation génique étaient nouveaux) (Figure 3).

Par coïncidence au cours de ce dépistage, ils ont également découvert une mutation dans une séquence signal de sécrétion (6) qui augmente considérablement la sécrétion de scFv (79G10 sur la figure 3a) (Référence : Ito et al., Eviter l’entrée dans les voies de dégradation des protéines intracellulaires par des mutations de signal augmente la sécrétion de protéines dans Pichia pastoris, Microbien. Biotechnologie, 2022.). Il s’agit d’une mutation d’un acide aminé (V50A) dans le Saccharomyces cerevisiae-dérivé de (7) peptide signal MFα.

Combiner plusieurs perturbations dans les gènes utiles identifiés

Les chercheurs ont procédé à perturber les gènes identifiés (obtenus par l’étape ci-dessus) dans une souche de production scFv de P. pastorisrévélant que l’accumulation de perturbations génétiques entraînait une augmentation de la productivité des protéines.

La souche avec de multiples perturbations de quatre des gènes identifiés a démontré une amélioration de la productivité par 5 par rapport à la souche parentale (Figure 4). De plus, les chercheurs ont montré que des perturbations (multiples) de ces gènes avaient le même effet, non seulement dans la souche productrice de scFv utilisée dans le criblage, mais également dans une souche productrice de β-glucosidase (8) et une souche scFv avec un autre promoteur à celui utilisé dans le criblage (Figure 4).

Culture en série de souches avec (plusieurs) perturbations génétiques

Dans les souches présentant des perturbations (multiples) dans chaque gène, ils ont constaté que la vitesse de P. pastoris la multiplication cellulaire a diminué à mesure que les perturbations génétiques s’accumulaient (figure 4). Pour restaurer la vitesse de multiplication de ces souches, ils ont répété le cycle de culture plus de 50 fois, permettant à chaque fois à la levure de se développer dans un milieu de culture frais. C’est ce qu’on appelle l’évolution adaptative en laboratoire (ALE). Grâce à cette technique, les chercheurs ont réussi à restaurer la multiplication cellulaire dans la majorité des souches perturbées, en plus d’augmenter leur productivité en scFv (Figure 5).

Grâce aux trois étapes décrites ci-dessus (1. Création d’une bibliothèque de perturbations génomiques aléatoires et criblage, 2. Combinaison de perturbations multiples dans les gènes utiles identifiés, 3. Culture de souches avec (perturbation(s) génique(s) multiple(s)), les chercheurs ont réussi à augmenter la production de protéines cibles, ce qui peut servir de méthode pour développer de nouvelles souches hôtes afin d’augmenter la production de protéines utiles dans P. pastoris.