Dans une étude récente publiée dans le bioRxiv* serveur de préimpression, des chercheurs de l’Université de médecine d’Innsbruck ont évalué les mutations 3CLpro du coronavirus 2 (SARS-CoV-2) du syndrome respiratoire aigu sévère responsables de la résistance à Paxlovid. La 3-chymotrypsine-like protease (3CLPro), ou protéase principale (Mpro), est la principale protéase retrouvée dans les coronavirus.
Étude : Les mutations SARS-CoV-2 3CLpro confèrent une résistance au Paxlovid (nirmatrelvir/ritonavir) dans un système sans gain de fonction basé sur le VSV.
Sommaire
Arrière plan
Les inhibiteurs de protéase sont l’un des agents antiviraux les plus puissants. La Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis (États-Unis) a récemment approuvé l’utilisation de Paxlovid (ritonavir/nirmatrelvir), le premier inhibiteur de protéase contre la protéase principale du SRAS-CoV-2, comme le 3CLpro et la protéine non structurelle 5 (Nsp5 ).
Le virus de l’hépatite de la souris (MHV) 3CLpro a été utilisé comme substitut du SARS-CoV-2 3CLpro pour recueillir des informations sur la résistance dans les enquêtes qui ont conduit à l’autorisation d’utilisation d’urgence (EUA) de Paxlovid. Le 3CLpro du MHV et du SARS-CoV-2 montre une similarité de séquence de 50 %. Notamment, il n’existe actuellement aucune preuve publiée sur la résistance au SRAS-CoV-2.
Remarquablement, les nouvelles variantes du SRAS-CoV-2 ont surpassé les vaccins actuels contre la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19). Par conséquent, une menace similaire existe pour les futurs médicaments antiviraux COVID-19.
À propos de l’étude
La présente étude a comparé SARS-CoV-2 3CLpro et un panel de protéases virales distinctes englobant MHV 3CLpro dans une expérience de gain de signal récemment établie pour établir des mutants SARS-CoV-2 3CLpro résistants à Paxlovid.
L’équipe a créé une variante chimérique du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV), remplaçant le domaine intergénique entre la polymérase (L) et la glycoprotéine (G) par le SARS-CoV-2 3CLpro. Il s’agissait d’établir un substitut sûr aux enquêtes sur le gain de fonction.
Pour l’analyse initiale de preuve de concept, les chercheurs ont sélectionné un mutant ciblant l’inhibiteur GC376, hébergeant la variation des acides aminés de la phénylalanine à la leucine en position 305 (F305L) dans le 3CLpro. En outre, le mutant F305L a été utilisé dans des recherches ultérieures sur la sélection de mutations pour analyser la possibilité que plusieurs mutations s’accumulent dans le 3CLpro.
et variante F305L pré-mutée (rouge **). Les mutants du site d’autoclivage sont colorés en turquoise, les mutants du site catalytique en vert, les mutants proches du site catalytique en vert clair et les mutants « allostériques » en blanc. Les virus avec plus d’une mutation sont affichés séparément et répertoriés af. Les fréquences des bases de données de séquences sont affichées sous les mutations en gris. Les mutations de Pfizer EUA sont divisées en mutations trouvées dans la culture cellulaire et séquencées à partir de patients traités. Des mutations supplémentaires du site de clivage distant en dehors du cadre de lecture ouvert 3CLpro sont représentées en bas. La couverture des entrées de mutation a été obtenue le 3 mars 2022. b : Visualisation des résidus affectés par la mutation. Les résidus qui ont subi une mutation sont surlignés en jaune, deux fois en orange clair, trois fois en orange foncé et quatre fois en rouge. Le dimère de protéase 3CLpro avec le nirmatrelvir lié a été visualisé dans ChimeraX à partir de la structure 7vh8 de la Protein Data Bank. Les mutations du centre catalytique se situent dans une plage de 5 ångström, comme visualisé en vert foncé.
Séquençage des mutants d’échappement et comparaison avec les bases de données de séquences et Pfizer EUA. a : les mutants ont été récupérés à partir de VSV-G-3CLpro-L de type sauvage
et variante F305L pré-mutée (rouge **). Les mutants du site d’autoclivage sont colorés en turquoise, les mutants du site catalytique en vert, les mutants proches du site catalytique en vert clair et les mutants « allostériques » en blanc. Les virus avec plus d’une mutation sont affichés séparément et répertoriés af. Les fréquences des bases de données de séquences sont affichées sous les mutations en gris. Les mutations de Pfizer EUA sont divisées en mutations trouvées dans la culture cellulaire et séquencées à partir de patients traités. Des mutations supplémentaires du site de clivage distant en dehors du cadre de lecture ouvert 3CLpro sont représentées en bas. La couverture des entrées de mutation a été obtenue le 3 mars 2022. b : Visualisation des résidus affectés par la mutation. Les résidus qui ont subi une mutation sont surlignés en jaune, deux fois en orange clair, trois fois en orange foncé et quatre fois en rouge. Le dimère de protéase 3CLpro avec le nirmatrelvir lié a été visualisé dans ChimeraX à partir de la structure 7vh8 de la Protein Data Bank. Les mutations du centre catalytique se situent dans une plage de 5 ångström, comme visualisé en vert foncé.
De plus, les auteurs ont déterminé 3CLpro résistant au nirmatrelvir en utilisant les souches mutantes et de type sauvage du SARS-CoV-2 F305L. Par la suite, ils ont examiné les régions 3CLpro et G et L voisines à travers les virus sélectionnés.
Les scientifiques ont classé les mutations trouvées dans la séquence 3CLpro en mutants d’autoclivage et de site catalytique. Les mutants allostériques ont été sélectionnés comme troisième catégorie pour toutes les mutations qui ne relevaient pas des deux premières. Ils ont recherché ces mutants particuliers dans l’EPICOV de l’Initiative mondiale sur le partage de toutes les données sur la grippe (GISAID) et la base de données virale du Centre national d’information sur la biotechnologie (NCBI).
Les dépositions du GISAID faites avant et après l’EUA de Paxlovid le 22 décembre 2022 ont été séparées en deux groupes. Les chercheurs ont sélectionné six échantillons de virus pour exécuter des études de cinétique de réplication et de dose-réponse par rapport à leur variante virale ancestrale afin de valider les mutations de résistance putatives révélées. Ils ont choisi des virus pour des évaluations complémentaires centrées sur deux critères. Dans un premier temps, les auteurs ont sélectionné des souches virales présentant des altérations du site catalytique. Deuxièmement, ils incluaient le mutant le plus répandu en dehors du noyau catalytique.
L’équipe a réintroduit quelques mutations de centre catalytique dans un outil d’évaluation de la fonction de la protéase récemment mis au point reposant sur un VSV incompétent pour la réplication. Il s’agissait d’étayer les résultats de résistance du VSV-G3CLpro-L compétent pour la réplication tout en excluant la possibilité que de nouvelles mutations se développent tout au long de l’essai dose-réponse. La méthode de lecture est passée d’un FluoroSpot à un tri unicellulaire activé par fluorescence (FACS) pour augmenter la sensibilité du test.
Résultats et conclusions
Les résultats de l’étude ont démontré que dans le test de gain de signal récemment établi, le MHV 3CLpro ne répond que modestement au nirmatrelvir. Bien que les structures du MHV et du SARS-CoV-2 3CLpro aient été significativement conservées, les scientifiques ont émis l’hypothèse que la faible identité de séquence d’acides aminés modifie considérablement l’affinité de la poche de liaison envers le nirmatrelvir pour produire une certaine résistance contre l’inhibiteur. Dans les 5 ngström ou moins, les principaux résidus correspondants de la poche de liaison : M165-L, H164-Q, P168-S, R188-A, V186-R, A191-V et T190-V étaient différents.
De plus, la séquence MHV 3CLpro présente déjà les altérations d’acides aminés F305L et Y126F observées dans l’expérience d’induction de mutation. Par conséquent, les chercheurs soutiennent que le MHV 3CLpro n’était pas le meilleur substitut pour les tests de résistance au 3CLpro.
Le mutant F305L a été trouvé dans une petite analyse de preuve de concept utilisant l’inhibiteur GC376 et présentait une résistance au GC376 et au nirmatrelvir et une cinétique de réplication légèrement rapide. L’ajustement de la zone d’autoclivage C-terminal de FQ (P2/P1) vers LQ (P2/P1), qui était un motif de reconnaissance privilégié, peut expliquer ces caractéristiques.
Des mutations des souches SARS-CoV-2 F305L et de type sauvage ont été détectées en utilisant la pression de sélection pour le nirmatrelvir, permettant aux mutants de contourner l’inhibiteur. Le phénotype de résistance de ces mutations a été confirmé en effectuant des tests dose-réponse et en introduisant à nouveau des mutations dans des systèmes de surveillance de l’activité des protéases récemment établis.
Les mutants réagissent différemment aux composés inhibiteurs en raison de leur différence structurelle, comme le démontre l’équipe en utilisant les exemples du nirmatrelvir et du GC376. Les résultats actuels pourraient aider l’adaptation de la structure composée dirigée à l’avenir.
Collectivement, les mutations SARS-CoV-2 3CLpro responsables de la résistance à l’inhibiteur de la protéase nirmatrelvir, telles que G138S, Y54C, L167F, A194S, Q192R et F305L, ont été découvertes dans la présente enquête. Ces résultats nécessitent une utilisation prudente des inhibiteurs de la protéase chez les patients à haut risque, car une utilisation non sélective extensive pourrait entraîner rapidement une résistance aux médicaments. *Avis important
bioRxivpublie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
