La thérapie génique promet de prévenir et de guérir les maladies en manipulant l'expression des gènes dans les cellules d'un patient. Cependant, pour être efficace, le nouveau gène doit pénétrer dans le noyau d'une cellule. L’incapacité de le faire de manière cohérente et efficace a entravé les progrès dans le traitement.
Des chercheurs de l'Université de Californie à San Diego, dirigés par le laboratoire du professeur Neal Devaraj du Département de biochimie et de biophysique moléculaire, ont dévoilé une nouvelle méthode qui augmente considérablement l'efficacité de la délivrance des gènes tout en minimisant les effets secondaires nocifs pour la cellule. Leur travail apparaît dans Communications naturelles.
Pour que la thérapie génique soit efficace, le gène introduit doit être délivré aux cellules cibles, pour finalement passer du cytoplasme de la cellule au noyau. Bien que la transmission des gènes dans le cytoplasme soit bien connue et standardisée, l’acheminement des gènes du cytoplasme vers le noyau peut s’avérer très difficile.
Pour compenser la faible efficacité de la translocation nucléaire (estimée à environ 1 %), les thérapies géniques potentielles peuvent nécessiter des doses très élevées d’ADN pour garantir qu’une quantité adéquate atteigne le noyau. Ces doses élevées peuvent déclencher des réponses immunitaires et une cytotoxicité.
La livraison de l'ADN dans le noyau peut être effectuée à l'aide de signaux de localisation nucléaire (NLS) – de courtes séquences peptidiques qui agissent comme des codes de courrier moléculaire en marquant certaines protéines pour leur transport dans le noyau. Attacher l’ADN au NLS lui permet de faire du stop dans le noyau. Bien que cette méthode soit en développement depuis plusieurs décennies, les résultats jusqu’à présent ont été incohérents et difficiles à reproduire.
Cette méthodologie a été confrontée à plusieurs défis, le plus important étant que, jusqu'à présent, la chimie n'était pas suffisamment développée pour permettre aux scientifiques d'observer et de comprendre réellement ce qui se passe lors de la livraison nucléaire ADN-NLS. La durée du NLS est-elle importante ? L’espace entre le NLS et l’ADN est-il important ? Les chercheurs utilisent-ils la mauvaise séquence NLS ? Devraient-ils attacher plusieurs NLS à l’ADN ?
Ce qu’il fallait, c’était trouver un moyen de filtrer toutes ces variables afin que les chercheurs puissent facilement identifier les permutations donnant les meilleurs résultats. C’est exactement ce que le laboratoire Devaraj a créé lorsqu’il a développé un flux de travail chimique capable de cribler facilement les conjugués ADN-NLS, permettant aux utilisateurs de définir les paramètres des conjugaisons.
En créant ce flux de travail, nous avons pu effectuer des criblages robustes, définissant essentiellement les règles de conception qui vous permettent d'attacher l'un de ces peptides NLS à une cassette de gènes d'ADN. Nous avons constaté une multiplication par dix de la délivrance d’ADN nucléaire. »
Zulfiqar Mohamedshah, étudiant diplômé en biochimie et premier auteur de l'article
Comment c'est fait
Le nouveau flux de travail a été adapté d’une technologie de marquage enzymatique de l’ADN, DNA-TAG, précédemment développée au laboratoire Devaraj. Dans ce travail, l’équipe a utilisé une enzyme TGT (ARNt guanine transglycosylase) dérivée d’une bactérie pour modifier l’ADN avec une manipulation chimique qui permet une fixation ultérieure et facile des peptides à l’ADN, y compris les peptides NLS.
Grâce à ce flux de travail, le laboratoire a pu modifier des cassettes de gènes d'ADN – des extraits mobiles d'ADN – avec des peptides NLS, puis modifier les paramètres du NLS : le type de NLS utilisé, l'espace entre le NLS et l'ADN, et le nombre de NLS attachés à l'ADN. La cassette génétique a été codée avec un rapporteur eGFP qui émet une fluorescence verte dans les cellules humaines lors de l'administration et de l'expression nucléaires.
De cette façon, ils ont pu examiner différentes permutations de conjugués ADN-NLS pour voir quelles combinaisons étaient les plus efficaces pour pénétrer dans le noyau. Ce nouveau flux de travail de criblage permet aux chercheurs de définir et de déployer avec précision les conjugués ADN-NLS avec la libération nucléaire la plus élevée.
« Nous avons pu obtenir une expression de l'ADN ciblé nucléaire supérieure à l'expression de l'ADN non modifié, à une quantité dix fois supérieure », a déclaré Devaraj, l'un des co-auteurs de l'article et directeur du département de biochimie. « Cela signifie que vous pouvez délivrer moins d'ADN à la cellule tout en augmentant son expression, ce qui devrait atténuer les problèmes de cytotoxicité. »
Le but ultime de toute thérapie génique est de guérir les patients malades. Pour tester leur flux de travail, l'équipe a donc livré une cassette génétique codant pour le facteur IX, une protéine déficiente dans la maladie de Noël, un trouble hémorragique rare et héréditaire. Leurs résultats ont montré une expression 10 fois plus élevée du facteur IX que les témoins, soulignant le potentiel des conjugués ADN-NLS pour les applications de thérapie génique non virale.
L'article est également l'un des premiers à montrer que des séquences spécifiques d'ADN-NLS fonctionnent mieux dans des types de tissus spécifiques : le tissu hépatique contenait des peptides NLS spécifiques qui étaient meilleurs pour la translocation nucléaire que s'ils étaient utilisés dans le tissu cardiaque ou rénal. Des recherches plus approfondies pourraient déterminer avec quelle précision ces conjugués ADN-NLS peuvent être déployés pour une administration spécifique à un tissu.
L'équipe aimerait étudier plus en détail si l'administration de conjugués ADN-NLS à la cellule diminue la réponse immunitaire – un autre obstacle avec ce type de thérapie génique. Ils étudient également l’utilisation du flux de travail pour améliorer les modifications de l’ADN génomique à l’aide de CRISPR-Cas-9 et espèrent continuer à affiner le flux de travail pour en faire quelque chose de plus traduisible et évolutif cliniquement, en le rapprochant du chevet du patient.
Liste complète des auteurs : Zulfiqar Y. Mohamedshah, Chih-Chin Chi, Ember M. Tota, Alexis C. Komor et Neal K. Devaraj (tous UC San Diego).
Financement fourni, en partie, par Seawolf Therapeutics, la Fondation Camille & Henry Dreyfus (ST-25-025) et les National Institutes of Health (R35GM141939 et T32GM146648).
