Une étude récente menée par des scientifiques de Celentyx Ltd, de l’Université de Birmingham et de l’Université de Warwick et publiée sur le bioRxiLe serveur de préimpression v* a illustré un test de fixation de la protéine de pointe (S) du coronavirus 2 (SRAS-CoV-2) du syndrome respiratoire aigu sévère basé sur les cellules.
Étude : Un test de liaison cellulaire aux protéines de pointe met en évidence les différences de capacité de neutralisation des anticorps pour les variantes du SRAS-CoV-2. Crédit d’image : Design_Cells / Shutterstock
Sommaire
Arrière plan
Une étape cruciale pour l’entrée du SRAS-CoV-2 dans les cellules humaines est la fixation de la protéine S du SRAS-CoV-2 avec le récepteur de l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2). Par conséquent, la prévention de cet engagement est un déterminant important de l’efficacité thérapeutique des anticorps sériques induits par la vaccination contre la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) et des anticorps monoclonaux thérapeutiques.
De plus, l’apparition de variants du SRAS-CoV-2 comme Omicron et Delta a rendu nécessaire le développement de tests flexibles qui pourraient évaluer l’efficacité des thérapeutiques COVID-19. Les variants du SARS-CoV-2 qui apparaissent pourraient montrer une résistance ou une évasion de la neutralisation par les anticorps monoclonaux du COVID-19 ou les anticorps produits par la vaccination centrée sur la souche initiale du SARS-CoV-2. En effet, la compréhension de ces contraintes guide les stratégies politiques et sanitaires face aux défis sociétaux amenés par la pandémie de COVID-19.
À propos de l’étude
L’objectif de la présente étude était d’établir un cadre réductionniste à base de cellules adapté à l’évaluation à haut débit qui mesure l’inhibition de l’adhérence de la protéine SARS-CoV-2 S aux cellules de mammifères appropriées pour faciliter le suivi immunitaire et le développement de thérapeutiques.
Initialement, l’équipe a exploré l’attachement d’une protéine SARS-CoV-2 S (SA) recombinante marquée par His aux lignées cellulaires épithéliales pulmonaires A549, soit surexprimant ACE2 (A549-ACE2), de type sauvage (A549-WT), ou surexprimant ACE2 et protéase transmembranaire, sérine 2 (TMPRSS2) (A549-ACE2-TMPRSS2). La protéine S marquée par His a été évaluée à l’aide d’un anticorps anti-His d’immunoglobuline G (IgG) de souris, d’un anticorps IgG anti-souris secondaire couplé au colorant Alexa Fluor 488 (AF488) et d’une imagerie à haute teneur mesurant l’intensité du marquage de la protéine S par cellule. Par la suite, l’attachement de plusieurs protéines S recombinantes aux cellules A549-ACE2 et A549-WT a été analysé.
Les effets de divers anticorps anti-S largement disponibles sur le marquage des cellules ACE2-A549 par SA et SF ont été évalués pour examiner l’efficacité du test actuellement conçu pour les tests d’anticorps monoclonaux. D’autres investigations ont été effectuées en utilisant trois anticorps. L’efficacité des anticorps du domaine de liaison au récepteur 8 (RBD8), RBD1 et RBD7 pour neutraliser l’infection par le SRAS-CoV-2 des cellules Vero a été explorée pour évaluer la signification translationnelle du test.
La performance du test de liaison S dans le plasma d’individus a été analysée avec des IgM/G/A anti-S mesurés par dosage immuno-enzymatique (ELISA) pour augmenter l’utilité potentielle de ce test. De plus, un score ≥ 1,0 était considéré comme positif dans cette évaluation. En outre, les performances de RBD8, RBD14 et RBD7 ont été comparées au marquage des protéines SARS-CoV-2 Omicron et Delta S des cellules A549-ACE2.
Marquage des cellules A549 exprimant ACE2 par des protéines de pointe recombinantes (A) Images confocales représentatives montrant le marquage des cellules A549 de type sauvage (A549-WT), surexprimant ACE2 (A549-ACE2) et surexprimant ACE2 et TMPRSS2 (A549-ACE2-TMPRSS2) par la protéine de pointe recombinante A (« Spike A ») et des anticorps de détection anti-His + AF488 conjugués anti-mIgG. (B) Images confocales représentatives montrant l’étiquetage des cellules A549 (A549-WT), des cellules A549 surexprimant ACE2 (A549-ACE2) et des cellules A549 surexprimant ACE2 et TMPRSS2 (A549-ACE2-TMPRSS2) par la protéine de pointe recombinante F (« Spike F » ) et anti-His + anticorps de détection anti-mIgG conjugués à AF488 (vert ; noyaux en cyan). (C) Quantification de l’intensité de marquage des protéines de pointe à partir d’images acquises par microscopie confocale à haut contenu pour les cellules marquées en (A) et (B). Données exprimées en moyenne + SEM de trois expériences indépendantes pour A549-ACE2 et de deux expériences indépendantes pour A549-WT.
Résultats et conclusions
Les résultats de l’étude ont montré que si le marquage des cellules A549-WT avec la protéine S était similaire aux concentrations de fond, les cellules A549 surexprimant ACE2 et TMPRSS2 et celles surexprimant ACE2 avaient un marquage ponctué de la protéine S. Le marquage de la protéine S était moins intense sur les cellules A549-ACE2-TMPRSS2 que sur A549-ACE2, ce qui pourrait être dû à différents niveaux d’expression d’ACE2 dans les lignées cellulaires. Un anticorps secondaire IgG anti-souris couplé à AF488 et un anticorps anti-RhoD1A4 ont montré un marquage clair lors de l’utilisation ultérieure d’une protéine S à l’intérieur d’une micelle détergente (SF), qui comprend vraisemblablement le trimère S dans sa structure native.
Caractérisation des anticorps bloquant la pointe Marquage des cellules A549-ACE2 par la protéine de pointe recombinante A (A) ou E (B) qui avait été pré-incubée en l’absence ou en présence des concentrations indiquées d’anticorps RBD1, RBD7 ou RBD8, suivie d’une détection en utilisant des anticorps anti-IgG anti-souris conjugués à l’anti-His + AF488, et la visualisation et la quantification de l’intensité de marquage de la protéine de pointe par microscopie confocale. Les tracés montrent les données exprimées en moyenne ± SEM de trois expériences indépendantes. Une ligne continue représente une régression non linéaire à l’aide d’une équation logistique à 4 paramètres. Les images confocales représentatives montrent l’étiquetage des cellules dans des conditions de contrôle ou avec une protéine de pointe pré-incubée avec 10 μg/mL RBD1, RBD7 ou RBD8.
Par la suite, l’analyse de diverses protéines S recombinantes dans les cellules A549-ACE2 et A549-WT a montré que l’adhérence à A549-WT était généralement médiocre. Néanmoins, différentes intensités de marquage étaient visibles dans les cellules A549-ACE2, certaines protéines S recombinantes montrant un signal faible. Ces résultats ont démontré que certaines protéines S recombinantes permettaient un marquage clair des cellules A549-ACE2.
Le marquage de SA et de SF a été diminué de manière cohérente par les anticorps RBD5, RBD1, RBD8 et RBD7. Le titrage des anticorps RBD7, RBD1 et RBD8 a démontré un blocage dépendant de la concentration du marquage des protéines S A et E, permettant la quantification des valeurs de concentration inhibitrice demi-maximale (IC50) de chaque anticorps. RBD1 avait la force la plus faible pour neutraliser l’infection virale, reflétant les résultats du marquage S avec SA ; cependant, RBD8 et RBD7 ont arrêté avec succès l’infection virale, RBD8 ayant une puissance plus élevée que dans l’expérience de liaison S. De plus, des échantillons de plasma humain avec des niveaux d’IgA/M/G anti-S supérieurs à trois ont montré une action de blocage du S dépendante de la concentration ; en revanche, ceux dont les taux d’IgA/M/G anti-S étaient inférieurs à trois n’en avaient pas. Ces découvertes impliquent que le présent test de liaison S pourrait caractériser les anticorps monoclonaux et suivre la fonction des anticorps neutralisants dans le plasma.
De plus, les auteurs ont découvert que si RBD14, RBD7 et RBD8 réduisaient considérablement le marquage par la protéine Delta S, seul RBD14 présentait une efficacité similaire contre la protéine Omicron S.
En résumé, l’équipe a créé une technique d’imagerie à haut contenu pour mesurer l’attachement de la protéine SARS-CoV-2 S aux cellules cibles exprimant ACE2 dans l’enquête actuelle. Les chercheurs envisagent que le dosage de la protéine S à base de cellules établi dans cette recherche compléterait les pseudovirus et les dosages biochimiques existants dans le développement thérapeutique du COVID-19. Il pourrait également être modifié pour fonctionner avec d’autres types de cellules afin d’explorer l’adhérence potentiellement autonome de l’ACE2 de la protéine SARS-CoV-2 S.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.