Dans une étude de validation de principe publiée dans Le microbe Lancetdes chercheurs australiens ont développé un test au point d’intervention pour la détection rapide du virus mpox (MPXV) dans des échantillons cliniques, basé sur une amplification isotherme ainsi que sur la technologie des protéines associées à CRISPR (Cas) regroupées et régulièrement espacées (CRISPR).
Le test s’est avéré très sensible et spécifique, et il a donné de bons résultats par rapport au test de référence par réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR). Un formulaire de test optimisé pourrait être utilisé pour détecter le MPXV dans des contextes communautaires et à faibles ressources.
Étude: Détection rapide du virus de la variole du singe à l’aide d’un test médié par CRISPR-Cas12a : une étude de validation et d’évaluation en laboratoire. Crédit d’image : Yéti en pointillé/Shutterstock.com
Sommaire
Arrière-plan
Le MPXV, un gros virus à acide désoxyribonucléique (ADN) double brin, provoque une maladie zoonotique appelée mpox (anciennement variole du singe). Les cas de Mpox ont été principalement signalés chez les hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes, mais ont également été observés chez les femmes et les nourrissons.
Entre juillet 2022 et mai 2023, l’Organisation mondiale de la santé (OMS) a déclaré le mpox comme une urgence de santé publique. Bien que le taux de transmission actuel du MPXV soit faible, son émergence soudaine, sa propagation rapide et le manque d’informations sur l’efficacité du vaccin nécessitent une vigilance rigoureuse, un diagnostic rapide et l’isolement des cas afin de prévenir de futures épidémies.
La méthode de diagnostic de référence actuelle pour la détection du MPXV est la qPCR, qui nécessite un équipement spécialisé et un personnel formé. De plus, la plupart des diagnostics actuels sont effectués dans des laboratoires spécialisés et il faut plusieurs jours après le prélèvement des échantillons pour obtenir des résultats, en particulier dans les contextes à faibles ressources.
Malgré le développement d’autres tests sur le lieu d’intervention, les données sur leur efficacité sont limitées. Pour tenter de combler cette lacune, dans la présente étude, les chercheurs ont conçu, évalué et validé un test CRISPR-Cas12a basé sur la fluorescence au point d’intervention, nommé «MPXV-CRISPR», qui pourrait potentiellement être déployé dans des contextes décentralisés pour détection rapide du MPXV.
À propos de l’étude
L’ADN génomique (ADNg) a été extrait de 185 échantillons cliniques anonymisés, y compris des échantillons de lésions buccales, anales et cutanées prélevés sur des personnes ayant subi un test qPCR pour le mpox. Le test qPCR comprenait des amorces pan-orthodoxes et une sonde spécifique au MPXV pour identifier le gène de l’hémagglutinine (B2R).
Une base de données de 523 génomes MPXV a été téléchargée du National Center for Biotechnology Information (NCBI) et utilisée pour concevoir des amorces d’amplification par recombinase polymérase (RPA) et des acides ribonucléiques guides CRISPR (ARNg) pour le test MPXV-CRISPR, ciblant les gènes hautement conservés de MPXV.
Vingt-deux ensembles d’amorces RPA ont été obtenus, flanquant sept ARNg. Les cibles ont été amplifiées via RPA dans un cycleur thermique et détectées à l’aide du clivage trans basé sur CRISPR-Cas12a de l’ADN simple brin marqué.
Au bout de 40 minutes et sur trois répétitions expérimentales, le point final du test a été mesuré à l’aide d’une lecture basée sur la fluorescence suivie d’une détection à flux latéral. Trois types d’échantillons de contrôle ont été utilisés au cours des tests : un contrôle sans guide, un contrôle sans modèle et au moins un contrôle d’ADNg viral non MPXV.
Les résultats des bandelettes à flux latéral ont été évalués en aveugle des résultats de fluorescence, manuellement à l’œil nu et par ordinateur à l’aide du logiciel ImageJ.
Alors que la sensibilité analytique du test a été évaluée à l’aide de dilutions en série d’ADNg, la spécificité analytique a été évaluée sur plusieurs agents pathogènes cutanés viraux courants, notamment le virus de la vaccine, le virus de l’herpès simplex de types 1 et 2, le virus du molluscum contagiosum, l’entérovirus (coxsackie B2), orf. virus et le virus varicelle-zona.
De plus, la précision intra-essai et inter-essai a été estimée à l’aide des valeurs moyennes de fluorescence.
Résultats
Le coefficient de variation moyen était de 5,2 % (± 3,5) pour l’analyse intra-essai et de 20,8 % (± 11,3) pour l’analyse inter-essai. Alors que la durée optimale de l’analyse était de 45 minutes, le temps optimal pour la lecture de la fluorescence était de 2 à 4 minutes, sur la base de l’analyse de la courbe des caractéristiques de fonctionnement du récepteur (ROC).
Dans l’étude de concordance aveugle sur l’ADN génomique extrait de 185 échantillons cliniques, le test a montré une sensibilité clinique de 100 % (1 copie par μL) et une spécificité de 99,3 % en utilisant la lecture par fluorescence par rapport au test qPCR et à un large panel d’agents pathogènes viraux et bactériens.
La lecture à flux latéral avec l’ensemble amorce-guide sélectionné a également atteint une sensibilité de 100 % (1 copie par μL) et une spécificité de 98,6 % pour le MPXV, sans réactivité croisée contre un panel d’autres virus.
Les lectures de fluorescence et de flux latéral ont montré une concordance de 96,8 %, sauf divergences liées à la charge virale. Cependant, l’étude est limitée par le faible nombre de cas positifs au MPXV (40) sur les 185 échantillons analysés et par le flux de travail modularisé pour l’extraction, l’amplification et la détection de l’ADNg.
Conclusion
Le test MPXV-CRISPR développé dans cette étude combine l’amplification basée sur la RPA avec la reconnaissance de cibles d’ADN médiée par CRISPR-Cas12a et le clivage de l’ADN simple brin. Il peut être lu à l’aide de méthodes de bandelettes basées sur la fluorescence et à flux latéral.
Dans l’ensemble, ce nouveau test peut être potentiellement utilisé dans les contextes à faibles ressources pour le diagnostic du MPXV au point d’intervention, car il peut être réalisé en 45 minutes environ et présente une sensibilité et une spécificité cliniques élevées par rapport au test qPCR standard.
Des recherches plus approfondies avec des amorces d’ARNg multiplexées ciblant un plus large éventail de lignées MPXV en circulation seraient bénéfiques pour faciliter des tests de diagnostic robustes et précoces contre le MPXV afin d’améliorer les résultats en matière de santé publique.
