Une étude révèle un nouveau repli dans la protéine non structurelle 9 du cofacteur de réplication du SRAS-CoV-2

Dans une récente étude publiée dans la revue PLOS Unles chercheurs présentent la structure cristalline d’un nanocorps spécifique anti-non structurel de la protéine 9 (nsp) en complexe avec le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) nsp9, qu’ils ont appelé nsp9_COV19.

Étude: De l’intérieur vers l’extérieur : la liaison des anticorps révèle des points charnières de repli potentiels dans le cofacteur de réplication du SRAS-CoV-2 nsp9. Crédit d’image : Kateryna Kon/Shutterstock.com

Arrière-plan

Nsp9 est un petit facteur accessoire qui joue un rôle crucial dans le complexe de réplication et de transcription de réplication (RTC) du coronavirus (CoV). De plus, nsp9 s’associe à la pseudokinase N-terminale Nidovirales Domaine nucléotidyltransférase (NiRAN) associé à l’ARN polymérase (RdRp) dépendante de l’acide ribonucléique (ARN) de nsp12, qui est produit à l’intérieur des cellules hôtes sous la forme d’une polyprotéine PP1ab auto-clivante.

Nsp12 contient un RdRp viral essentiel qui, conjointement avec nsp7 et nsp8, devient les composants centraux du RTC. Nsp9 a un pli viral distinct, une protéine de liaison à l’ARN et un élément clé pour le coiffage de l’ARN messager viral (ARNm). Cette protéine recrute également d’autres protéines pour le coiffage du 5′-ARNm viral, qui est un aspect essentiel de la réplication virale, faisant ainsi de nsp12 une cible thérapeutique potentiellement viable.

Dans le modèle de coiffage du SARS-CoV-2, les domaines nsp9 et NiRAN agissent conjointement comme une polyribonucléotidyltransférase (PRNTase) avec des résidus catalytiques et accepteurs d’adduits sur différentes chaînes d’acides aminés.

Les VHH sont des nanocorps dérivés d’immunoglobulines (Ig) de camélidés avec des domaines lourds variables. Des études antérieures ont montré que ces nanocorps pourraient être hautement spécifiques pour nsp9. De même, plusieurs études ont identifié de nombreuses petites molécules ayant une affinité pour nsp9_COV19 et le potentiel d’inhiber l’engagement de NiRAN et, par conséquent, d’empêcher la RNAylation et le coiffage du SRAS-CoV-2.

À propos de l’étude

Dans la présente étude, les chercheurs décrivent la flexibilité de nsp9. A cet effet, nsp9 et anti-nsp9 VHH_2nsp23 complexes ont été purifiés et co-complexés par filtration sur gel. Ensuite, la structure cristalline de ce complexe a été examinée à une résolution de 2,4 Å en utilisant la diffraction des rayons X.

Après de nombreux tours, l’équipe a finalement construit et affiné une structure cristalline du VHH_2nsp23-état lié de nsp9_COV19qui avait deux copies du nsp9_COV19: VHH_2nsp23 complexe au sein de la superposition d’unités asymétriques.

La protéine 53 liée à la transformation (Trp-53) s’est avérée être une caractéristique principale de l’interface étendue de liaison aux anticorps de nsp9_COV19, dans lequel la boucle CDR3 formait une interaction de feuillet β étendue. La liaison des nanocorps a déclenché des modifications topologiques à grande échelle du pli coronaviral unique de nsp9, qui ont déformé tous les éléments interagissant avec NiRAN de nsp9.

Cependant, on ne sait toujours pas si la liaison VHH a induit artificiellement cet état de liaison ou s’il s’agissait d’un état structurel préexistant alternatif ou d’un intermédiaire de repliement qui est resté piégé à l’intérieur de nsp9.

Un diagramme de Kleywegt a été utilisé pour explorer les points potentiels de flexibilité dans le pli nsp9 et comparer les états liés et non liés de nsp9_COV19. Les distances de Ramachandran ont également été cartographiées entre chaque état sur le nsp9_COV19 structure.

Résultats

Le VHH_2nsp23 site de liaison sur nsp9_COV19 était vaste, dans laquelle les résidus dans le ^VHHCDR2 et ^VHHLes boucles CDR3 constituaient respectivement 27 % et 66 % de l’interface de liaison.

Le ^VHHRésidus CDR3 ¹⁰³YYFST¹⁰⁷ exécuté en antiparallèle avec le nsp9_COV19 s5-brin et formé quatre liaisons hydrogène (H) de feuillet β. Ces résidus ont également établi des interactions squelette-chaîne latérale avec ^VHHThr-107. De plus, le ^VHHBoucle CDR2 de VHH_2nsp23 ont contribué des contacts substantiels qui étaient entièrement médiatisés par la sidechain dorsale.

Trp-53 de nsp9_COV19 était coincé entre^VHHMet-50 et ^VHHIle-52, qui sont tous deux des résidus hydrophobes. Ensemble, huit liaisons H spécifiques d’un épitope, de multiples interactions de van der Waals et un pont de sel ont contribué à l’anti-nsp9_COV19spécificité de VHH_2nsp23.

Après la liaison VHH, les auteurs ont noté que la forme native sans ligand de nsp9_COV19 a subi quelques réaménagements structurels. À cette fin, le repositionnement de l’hélice α depuis l’extérieur du mini barillet β et entre les boucles s2-s3 et s4-s5 espacées de 30 Å a été observé. Néanmoins, la plupart des éléments β-structuraux de nsp9_COV19 reste topologiquement proche dans l’état lié.

D’autres points structurels dans le pli nsp9 qui pourraient servir de points charnières ont également été identifiés. Leu-42, par exemple, résidait et formait un brin β droit standard dans le VHH_2nsp23-état lié, tandis que dans l’état apo, Leu-42 résidait à un point de coude, permettant ainsi à s3 de se détourner de αC. Le mouvement à grande échelle de αC a été principalement facilité par des déplacements de squelette dans les résidus Lys-92/Gly-93, qui VHH_2nsp23 directement contacté.

Pendant le coiffage de l’ARNm viral en 5′, l’extrémité N-terminale de nsp9_COV19 s’insère dans le domaine nsp12 NiRAN, qui est médié par les traits du pli apo-nsp9. Ces traits incluent le motif d’interaction GxxxG et l’extrémité N-terminale se projetant dans son site actif.

Ce nouvel état conformationnel de la boucle s2-s3 et les éléments déformés αC réalignés engagés

conclusion

L’épitope de liaison VHH_2nsp23 a été défini en résolvant sa structure cristalline avec nsp9_COV19. Comme indiqué précédemment dans les essais de perturbation chimique des pics de résonance magnétique nucléaire (RMN), le VHH_2nsp23 l’épitope semblait cibler des résidus dans les brins s4 et s5 de nsp9 et se concentrait spécifiquement sur Trp-53. Des réarrangements structurels supplémentaires ont donné naissance au VHH_2nsp23-architecture liée de nsp9_COV19.

Ce nouveau VHH_2nsp23-l’état lié de nsp9 pourrait sembler physiologiquement non pertinent à l’heure actuelle. Cependant, sa formation a permis plus de liberté pour l’extrémité N-terminale nsp9 suite à la perte du berceau Tyr. Cette structure avait également plusieurs points structurels dans le pli distinct nsp9 qui pourraient agir comme des points charnières. Par conséquent, bien qu’ils se produisent sur un site plus éloigné du site d’interaction NiRAN, ces changements structurels pourraient perturber une interface protéique.

Ce nouvel état lié au VHH de nsp9_COV19 l’encapsulation cryptique de l’hélice α C-terminale de nsp9 devrait être étudiée en tant que thérapeutique potentielle du COVID-19, car il a été démontré qu’elle limite l’engagement de NiRAN, ce qui peut empêcher la RNAylation du SRAS-CoV-2 et le coiffage de l’ARNm 5′.