Dans un récent medRxiv * preprint manuscript, des chercheurs de Singapour et des États-Unis rapportent le développement d'une méthode numérique CRISPR pour la détection sensible, spécifique et rapide des acides nucléiques viraux à température constante, qui pourrait être exploitée pour la détection du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2 (SRAS-CoV-2).
Pour lutter contre la propagation mondiale de la maladie à coronavirus (COVID-19), des méthodes améliorées de détection du SRAS-CoV-2 et de quantification de la charge virale sont nécessaires de toute urgence. Bien que la réaction en chaîne par transcription inverse-polymérase (RT-qPCR) soit un étalon-or actuel, la quantification nécessite des normes externes ou des références avec des résultats souvent variables.
C'est là que la PCR numérique entre en jeu, avec une détection très sensible et une analyse de la charge virale du SARS-CoV-2; néanmoins, le temps de réaction est long et prend environ quatre heures par rapport à la qPCR, qui nécessite une heure.
De même, les méthodes basées sur CRISPR peuvent également détecter le SRAS-CoV-2 en une heure mais ne permettent pas la quantification absolue des particules virales, ce qui réduirait la variabilité inter-laboratoires et ouvrirait encore plus le champ scientifique.
Cet effort de recherche, dirigé par le Dr Xiaolin Wu de l'Alliance Singapour-MIT pour la recherche et la technologie, révèle une approche RApid DIgital Crispr optimisée (RADICA) qui permet la quantification absolue des acides nucléiques viraux à température constante en une heure.
Illustration schématique de RADICA. a, Le flux de travail de partitionnement d'échantillons RADICA sur une puce pour la quantification absolue des cibles d'acide nucléique. Généralement, après l'étape d'extraction d'ADN / ARN, différents types d'échantillons cliniques peuvent être utilisés pour la détection et la quantification de diverses cibles. Le mélange d'échantillons contenant de l'ADN / ADNc, des réactifs RPA et des sondes Cas12a-crRNA715 FQ est distribué au hasard dans des milliers de partitions. Dans chaque partition, l'ADN est amplifié par RPA et détecté par Cas12a-crRNA, résultant en un signal fluorescent dans la partition. Sur la base de la proportion de partitions positives et de la distribution de Poisson, le nombre absolu de copies de la cible d'acide nucléique est quantifié. b, Illustration de la réaction RPA-Cas12a dans chaque partition positive. Dans chaque partition contenant l'acide nucléique cible, les amorces se lient à l'acide nucléique cible et initient l'amplification à l'aide de la recombinase et de l'ADN polymérase. En raison du déplacement de brin de l'ADN polymérase, les sites ADNsb ciblés sur l'ARNr exposés sont liés par des complexes Cas12a-ARNr. Cas12a est ensuite activé et clive les reporters FQ à proximité pour produire une lecture de fluorescence.
Sommaire
Réaction en un seul pot simplifiée sur une puce commerciale haute densité
La méthode présentée dans cet article combine tous les avantages de la PCR numérique quantitative, de l'amplification isotherme rapide, ainsi que de la détection CRISPR spécifique dans un système de réaction à un pot qui sépare les réactions individuelles en dix mille compartiments sur une puce commerciale à haute densité.
Une telle réaction en un seul pot simplifiée combine la détection basée sur CRISPR et l'amplification d'acide nucléique en une seule étape dans un tube fermé, ce qui réduit considérablement le risque de contamination croisée des échantillons pendant le traitement par lots.
À des fins de validation, de l'ADN contenant le gène nucléoprotéique du SARS-CoV-2 a été utilisé, ce qui a montré une réponse signal-entrée linéaire. En outre, RADICA a été comparé à la PCR numérique pour quantifier l'ADN synthétique du SRAS-CoV-2 et l'ADN viral d'Epstein-Barr (EBV).
Les chercheurs ont également testé les effets inhibiteurs possibles de l'ADN de fond sur les réactions qui ont été effectuées dans de petites partitions. La fonction isothermique du test de détection basé sur RADICA utilise un simple bain de chaleur à température constante, qui peut permettre une détection virale rapide qui peut être utilisée même dans les zones à faibles ressources.
Effet combiné de la précision et de la vitesse
Dans cette étude, l'utilisation de la méthode RADICA a abouti à des limites de sensibilité et de détection comparables à celles de la PCR en temps réel et d'autres méthodes isothermes, avec la capacité de quantification absolue. De plus, un avantage significatif de RADICA observé dans cette étude était sa rapidité.
La quantification absolue susmentionnée de l'ADN a montré une plage dynamique de 0,6 à 2027 copies par microlitre, sans aucune réactivité croisée sur des virus similaires ou de l'ADN de fond humain. Les résultats de cette étude suggèrent également que l'ADN de fond n'inhibera pas la réaction de l'échantillon RADICA dans la plage dynamique qui sera utilisée à des fins de test.
De plus, en ce qui concerne la vitesse, RADICA peut détecter et quantifier avec précision l'acide nucléique en une heure sans cycle thermique, ce qui est une alternative quatre fois plus rapide que la détection de virus par PCR numérique.
Utilisations potentielles de la technologie de pointe
«Nous avons établi et caractérisé RADICA, qui combine la vitesse et la sensibilité de l'amplification isotherme, la spécificité de la détection basée sur CRISPR et la capacité à obtenir une quantification absolue par partitionnement d'échantillons», les auteurs de l'étude résument leur avancée méthodologique.
L'approche de quantification absolue pour la détection virale peut non seulement soutenir un traitement clinique plus facile, mais pourrait également être exploitée à des fins de recherche. Et comme les charges virales peuvent être liées au risque de transmission et à la gravité de la maladie (comme c'est le cas avec le SRAS-CoV-2), cela peut également s'avérer essentiel pour lutter contre cette pandémie.
Les travaux futurs se concentreront sur l'expansion des applications de RADICA dans des domaines scientifiques tels que l'analyse de l'expression génique, la détection de mutants rares, la quantification des bibliothèques de séquençage et la variation du nombre de copies – avec des avantages significatifs pour les domaines cliniques, pharmaceutiques, écologiques et de santé publique.
*Avis important
medRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé ou être traités comme des informations établies.
