Les actions d’un médicament ou d’une cible moléculaire in vitro souvent ne sont pas traduits dans un cellulaire ou in vivo le contexte. La perméabilité de la membrane, les effets hors cible et la cytotoxicité sont quelques-uns des facteurs qui peuvent contribuer à cette différence. Il s’agit d’un énorme goulot d’étranglement dans les efforts visant à identifier d’urgence de nouvelles thérapies antivirales, en particulier à la suite de la pandémie de coronavirus 2019 (COVID-19).
L’agent étiologique du COVID-19 est le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2). Il a infecté plus de 123,5 millions de vies et causé plus de 2,7 millions de morts. Le seul agent antiviral le plus prometteur contre le SRAS-CoV-2 actuellement utilisé en clinique est le remdesivir, inhibiteur de l’ARN polymérase ARN-dépendant. Cependant, il a présenté des résultats et des effets secondaires mitigés.
Alors que des vaccins efficaces contre le SRAS-CoV-2 sont maintenant administrés dans de nombreuses régions du monde, on soupçonne que le virus peut persister et continuer à infecter les humains. En outre, les variantes émergentes peuvent contribuer à la circulation du virus et à l’infection.
Pour lutter contre cette épidémie de SAR-CoV-2 et tout éventuel futur coronavirus zoonotique, il est essentiel de disposer d’outils efficaces – des dosages biochimiques directs – qui fournissent des informations plus pertinentes sur le plan physiologique et permettent l’étude de phénotypes tertiaires complexes tels que la réplication virale.
Actuellement, les tests de neutralisation par réduction de plaque conventionnels (PRNT) sont l’étalon-or pour la quantification de la réplication virale. Cependant, le faible débit et le long délai d’exécution de ces tests limitent leur utilité pour le criblage à grande échelle de médicaments ou de sérums.
Pour répondre à un besoin urgent d’un test cellulaire simple et à haut débit, pour quantifier une infection authentique par le SRAS-CoV-2 et de nouvelles variantes cliniques, les chercheurs ont exploité la présence d’une activité de protéase virale. Les protéases du SRAS-CoV-2 sont des cibles thérapeutiques intéressantes.
Dans une nouvelle étude publiée récemment sur le bioRxiv * serveur, ils ont généré des biocapteurs fluorescents et luminescents activables par la protéase pour l’activité SARS-CoV-2 MPro (protéase principale) et PLPro (protéase de type papaïne), l’un basé sur le «flip» GFP (FlipGFP), et l’autre basé sur une permutation circulaire luciférase de luciole (FFluc). L’équipe, de l’Université de Cambridge et du NHS Blood and Transplant, Cambridge, Royaume-Uni, a développé une lignée cellulaire reporter luminescente sensible qui quantifie avec précision le virus infectieux du SRAS-CoV-2.
Par rapport aux virus rapporteurs fluorescents ou luminescents de rétro-ingénierie, l’un des principaux avantages de notre lignée cellulaire reporter luminescente est la possibilité de détecter une gamme d’isolats cliniques du SRAS-CoV-2, y compris des variantes émergentes préoccupantes.
Les chercheurs ont confirmé la spécificité et l’utilité de ces reporters en utilisant des protéases virales recombinantes. Ils ont établi que ces journalistes pouvaient détecter et quantifier les cellules infectées.
Enfin, ils ont développé une lignée cellulaire reporter luminescente stable, dans laquelle le FFluc est activé par l’expression de PLPro au cours de l’infection par le SARS-CoV-2. Ils ont démontré l’utilité de ces cellules dans des dosages d’antiviraux à petites molécules et d’anticorps neutralisants en utilisant un SARS-CoV-2 de type sauvage.
Dans ce travail, ils ont démontré son utilité pour le criblage de médicaments et le titrage des anticorps neutralisants.
Après avoir généré des reporters de protéase SARS-CoV-2 basés sur FlipGFP, ils ont testé si ces biocapteurs pouvaient détecter l’activité de la protéase SARS-CoV-2 dans les cellules. Des trois journalistes étudiés ici, ils ont observé le signal le plus fort du journaliste PLP2-FlipGFP.
En outre, ils ont également confirmé que les biocapteurs SARS-CoV-2 sélectionnés sont spécifiques de leurs protéases apparentées et activés d’une manière strictement dépendante de la séquence.
Les données de cette étude soutiennent le principe selon lequel les tests cellulaires pour les composés antiviraux sont mieux corrélés avec l’activité contre la réplication virale que les tests in vitro, ont déclaré les chercheurs.
En utilisant la lignée cellulaire HEK293T surexprimant ACE2 et furine (appelées cellules HEK293T-ACE2), les chercheurs ont démontré que lors d’une infection par le SRAS-CoV-2, l’expression de la protéase virale activait les reporters basés sur FlipGFP. Ainsi, les biocapteurs activables par la protéase peuvent être exploités pour signaler une infection par le SARS-CoV-2. Cependant, l’étude a souligné qu’elle n’a pas réussi à démontrer une fenêtre utilisable pour des expériences à haut débit.
Ils ont généré un rapporteur de protéase SARS-CoV-2 basé sur la luciférase qui peut quantifier l’infection SARS-CoV-2, et ont également développé un test luminescent facile pour cribler les inhibiteurs de la réplication du SARS-CoV-2.
À l’aide de ce test cellulaire, les chercheurs ont différencié, à partir d’un panel d’inhibiteurs, les composés capables d’inhiber la réplication virale (GC373 et GC376) et ceux qui ne le sont pas (carmofur, disulfirame, PX-12, tideglusib).
Pour une lignée cellulaire reporter luminescente sensible pour les dosages médicamenteux, de neutralisation et virologiques généraux, les chercheurs ont ensuite développé une lignée cellulaire stable, les cellules HEK293T-ACE2-30F-PLP2; utilisé avec une simple lecture luminescente.
La première lignée cellulaire reporter luminescente stable pour l’infection par le SRAS-CoV-2 générée dans cette étude est parfaitement adaptée aux criblages à haut débit de composés antiviraux candidats ou d’anticorps thérapeutiques, et / ou à des enquêtes sérologiques à grande échelle pour neutraliser l’activité contre le virus authentique.
En conclusion, les chercheurs de cette étude ont développé une boîte à outils polyvalente de reporters fluorescents et luminescents à base de cellules activés par les protéases du SRAS-CoV-2.
Nos données établissent la faisabilité de biocapteurs activables par des protéases pour la détection de l’infection par le SRAS-CoV-2 et démontrent l’utilité pratique d’une lignée de cellules rapporteurs à base de luciférase pour la quantification des cellules infectées, les tests de médicaments et les tests sérologiques.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
