Dans une récente étude publiée sur medRxiv*preprint server, une équipe de chercheurs israéliens a développé et validé de nouveaux tests de transcriptase inverse – réaction en chaîne par polymérase quantitative (RT-qPCR). Les nouveaux tests permettent l’identification et la différenciation rapides et à haut débit des variantes Omicron BA.1 et BA.2 du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2 (SARS-CoV-2).
Étude : LES NOUVEAUX TESTS RT-qPCR PERMETTENT LA DÉTECTION ET LA DIFFÉRENCIATION RAPIDES ENTRE LES VARIANTES SARS-COV-2 OMICRON (BA.1) ET BA.2. Crédit d’image : NIAID
Les variantes Omicron BA.1 et BA.2 sont apparues et se sont rapidement propagées à travers le monde en quelques mois. La différence entre la pathogénicité, l’infectivité et l’évasion vaccinale des variantes Omicron BA.1 et BA.2 co-circulantes n’a pas été entièrement comprise. Cela pose un défi considérable pour une surveillance efficace, rendant les informations obtenues à partir des cultures cellulaires et du séquençage du génome entier insuffisantes pour fournir des données rapides et fiables.
En raison de l’impact significatif des variantes Omicron BA.1 et BA.2 sur la santé publique, il existe une forte demande pour le développement d’un outil de diagnostic permettant d’identifier rapidement ces variantes émergentes.
Sommaire
Étudier le design
Dans cette étude, des échantillons d’écouvillonnage nasopharyngé de patients ont été prélevés et l’acide ribonucléique (ARN) a été extrait pour des tests cliniques. Des cellules Vero-6 ont été infectées avec les échantillons d’écouvillonnage et le virus cultivé a été analysé par extraction d’ARN et PCR successive.
Des mutations spécifiques dans les variantes Omicron BA.1 et BA.2 ont été identifiées en alignant les séquences complètes du génome des variantes SARS-CoV-2 Wuhan (A19), Delta, Omicron (BA.1) et Omicron (BA.2). Les chercheurs ont obtenu des séquences du génome de l’initiative mondiale sur le partage de toutes les données sur la grippe (GISAID), et les séquences ont été alignées et analysées par le progiciel Geneious. Pour garantir le caractère unique de chaque mutation, les régions sélectionnées ont de nouveau été analysées via les outils du site Web NextStrain. Les sondes et les amorces ont été conçues et testées par le programme Primer 3.
Des tests multiplex RT-qPCR ont été effectués à l’aide de séquences de sondes et d’amorces spécifiques utilisées dans l’étude pour chaque réaction. Diverses conditions de cycle pour les réactions Omicron (températures, temps de réaction et concentrations variables) ont été utilisées et la fluorescence a été examinée dans l’étape d’extension de chaque cycle.
Les séquences cibles de la qPCR couvrant la région ont été amplifiées puis transcrites en ARN à l’aide d’un kit de transcription in vitro. Enfin, la purification et la quantification du produit obtenu in vitro l’ARN transcrit (IVT) a été réalisé. Pour chaque réaction, des courbes d’étalonnage ont été générées à l’aide d’étalons synthétisés et la limite analytique de détection a été estimée.
Résultats
Les chercheurs ont analysé les séquences complètes du génome des souches SARS-CoV-2 Wuhan (A19), Delta (B.1.617.2), Omicron (BA.1) et BA.2. Ils ont identifié et sélectionné quatre séquences spécifiques et identiques pour les variantes BA.1 et BA.2, des séquences uniques à BA.1 ou BA.2 et des séquences absentes des génomes de Wuhan et Delta. La délétion en position 31 acides aminés (N31del) dans le gène de la nucléocapside (N) était commun pour Omicron BA.1 et BA.2.
Spécificité des mutations cibles PCR sélectionnées. Les mutations cibles sélectionnées pour la conception de qPCR ont été identifiées par rapport aux souches en circulation en utilisant les données basées sur GISAID avec le logiciel d’analyse phylogénétique NextStrain. Les clades contenant les mutations sélectionnées sont mis en évidence dans chaque dendrogramme. L’annotation de clade (BA.1, BA.2) est marquée d’une étiquette et d’une ligne.
La délétion à la position 211 des acides aminés et l’insertion aux positions 214-216 dans le gène de la pointe (S) étaient exclusives pour la variante BA.1. Alors que la délétion à la position 24 acides aminés dans le gène S (S24del) et la sous-station de codons à la position 61 acides aminés du gène du cadre de lecture ouvert (Orf6) étaient toutes deux uniques au variant BA.2. Quatre réactions qPCR basées sur des sondes ont été conçues sur la base de ces mutations. La sonde dans chaque réaction était complémentaire des séquences mutées.
La sensibilité analytique de la nouvelle réaction a été déterminée. Le S24del a été fusionnée dans un multiplex contenant la réaction E-sarbeco et la réaction RNAse P humaine. Une dilution en série des cibles IVT analogue à la réaction multiplex testée a été réalisée. Au total trois réactions multiplex ont été dosées : E-sarbeco + S211delE-sarbeco + S24del + N31del + hRNAse P et E-sarbeco + Orf6D61L. Post-analyse de la courbe d’étalonnage, une limite analytique de détection entre une à dix copies par réaction a été notée pour la hRNAse P, E-sarbeco, S24delet n31del.
L’équipe a observé que sur les 36 échantillons cliniques examinés, quatre échantillons étaient caractérisés comme non-BA.1/BA.2 (précédemment détectés comme Delta), 10 étaient reconnus comme BA.1 (anciennement détectés comme Omicron) et 21 étaient caractérisé comme BA.2. Un échantillon était positif dans le N31del réaction uniquement avec une valeur de cycle de quantification (Cq) de 38,99 et donc classé comme un « échantillon non classé ». Pour l’échantillon cultivé et l’échantillon clinique faible, les valeurs de Cq variaient entre neuf et 41, respectivement. Cela a démontré que pour les échantillons cliniques, la sensibilité de la réaction était cohérente avec les résultats de l’étalonnage de la sensibilité analytique.
Conclusion
Les nouveaux tests RT-qPCR développés dans cette étude sont sensibles et simples dans la détection et la différenciation des variantes co-circulantes du SARS-CoV-2 Omicron BA.1 et BA.2. Ces tests peuvent être utilisés dans les laboratoires de recherche et de diagnostic comme outil pour tester des échantillons environnementaux et cliniques
Les nouveaux tests présentent plusieurs avantages, notamment des réactions spécifiques et la capacité de faire la distinction entre BA.1/BA.2 et non-BA.1/BA.2 en un seul test. De plus, les tests ont pu différencier des variantes étroitement apparentées mais non identiques. Enfin, ils ont détecté l’ARN BA.1 et/ou BA.2 en testant des échantillons environnementaux qui représentaient un pool hétérogène de diverses sources individuelles.
*Avis important
medRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
