Malheureusement, nous nous sommes familiarisés avec le fardeau des maladies virales au cours des deux dernières années, la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) coûtant la vie à des millions de personnes dans le monde.
Même si la grippe ne fait généralement pas la une des journaux, il n’est pas rare que des épidémies de virus entraînent plus de 650 000 décès par an – voire plus lorsque les épidémies non annuelles irrégulières sont prises en compte.
Il est courant que les virus de la même espèce présentent des différences significatives de forme et de taille – le pléomorphisme. Par exemple, dans la grippe, les particules virales peuvent être vues comme des sphères de 100 nm de diamètre à de longs filaments étirés pouvant atteindre plusieurs microns de diamètre.
D’autres virus connus pour présenter un pléomorphisme comprennent Ebola, la rougeole et le virus de la maladie de Newcastle. Malheureusement, ce pléomorphisme est mal compris et présente un obstacle à une meilleure compréhension de la structure et de la morphologie des virus.
Aujourd’hui, des chercheurs de l’Université d’Oxford et de l’Université de Warwick ont collaboré pour développer une méthode permettant de mieux comprendre et évaluer ces pléiomorphismes. Les travaux des chercheurs sont actuellement disponibles sur le bioRxiv* serveur de préimpression en attendant l’examen par les pairs.
Les particules grippales ont tendance à prendre l’une des trois formes suivantes : des sphères d’environ 120 nm de diamètre, des bacilliformes ellipsoïdales, capsulaires ou en forme de haricot d’environ 120 à 250 nm de diamètre, ou des filaments de plus de 250 nm de longueur. Ceux-ci sont entourés de bicouches lipidiques qui contiennent des pointes de protéines de surface intégrées, environ 375 au total. Ce sont principalement de l’hémagglutinine (HA), mais environ un septième sont de la neuraminidase (NA). Les pointes de NA ont tendance à former des amas, souvent à l’extrémité opposée du pôle au génome viral. Sous cette couche de surface se trouve une matrice de protéines structurelles, et en dessous se trouve le génome. La plupart de ces informations ont été recueillies par microscopie électronique – la microscopie à fluorescence n’a généralement pas la résolution nécessaire pour détecter la plupart des virus, ce qui rend la visualisation détaillée des particules individuelles presque impossible.
Imagerie à haut débit de la grippe par microscopie à super-résolution A) Schéma du protocole d’étiquetage. Les échantillons de virus ont été séchés directement sur des lamelles de verre recouvertes de poly-L-lysine avant d’être fixés, perméabilisés et colorés avec des anticorps en utilisant un protocole d’immunofluorescence standard. B) Un champ de vision représentatif (FOV) d’une image à grand champ de la grippe marquée A/Udorn/72, imagée dans le canal vert. Barre d’échelle 10 m. C) Un FOV représentatif d’une image grand champ d’un échantillon de virus négatif, imagé dans le canal vert. Barre d’échelle 10 m. D) L’image dSTORM correspondante du FOV en B), où HA est étiqueté en vert et NA est étiqueté en rouge. Barre d’échelle 10 m. EG) Zoom sur les images de D) montrant des filaments individuels et des particules sphériques. Barre d’échelle 5 m.
Malheureusement, la microscopie électronique est coûteuse et lente. Les chercheurs ont créé une technique pour promouvoir l’imagerie à haut débit des virions filamenteux en combinant la microscopie à reconstruction optique stochastique directe (dSTORM) – une méthode avec une résolution inférieure à 20 nm – et un logiciel d’analyse automatisé rapide pour permettre d’identifier et d’analyser des milliers de virions. à la fois.
Les scientifiques se sont concentrés sur une souche déjà bien caractérisée de la grippe-influenza A/Udorn/72, qui présente à la fois des phénotypes sphériques et filamenteux.
En revêtant le verre de polymères linéaires chargés positivement de poly-L-lysine ou de chitosane, ils ont pu immobiliser les particules virales sur les lames. Les particules virales ont été séchées directement sur des lamelles recouvertes de poly-L-lysine et imagées à l’aide d’un microscope à fluorescence à réflexion interne totale à grand champ. Dix mille images d’un seul champ de vision (FOV) ont été prises pour générer une image haute résolution d’un grand nombre de particules sphériques et filamenteuses de différentes longueurs. Ces images ont montré une population apparemment aléatoire de particules de filament avec des degrés de variabilité remarquables, allant de 250 nm à plusieurs microns de long. Certains filaments viraux étaient plus gros que la limite de diffraction utilisée et nécessitaient des images à grand champ avec des signaux limités par la diffraction.
Le virus a été marqué avec un anticorps anti-HA qui a permis à un pipeline d’analyse automatisé rapide de mesurer la longueur de ces filaments.
Après avoir ajusté les images et exclu toutes les particules inférieures à 234 nm (car elles seraient inférieures à la limite de diffraction), les chercheurs ont utilisé un logiciel pour combler les lacunes des particules virales avec des zones non étiquetées et ont pris la forme la plus simple possible.
Les longueurs de ces formes ont été supposées être les longueurs des particules virales. Près de 500 FOV individuels ont été imagés et plus de 46 000 particules filamenteuses ont été mesurées.
L’analyse a révélé que la grande majorité des filaments mesuraient moins de 1000 nm de long. Ceci est corroboré par des études antérieures montrant un risque accru de rupture des filaments sur de plus grandes longueurs. dSTORM et un algorithme de clustering DBSCAN ont été utilisés pour analyser des molécules plus petites, et l’organisation des protéines de surface a été étudiée par analyse d’intensité et transformations de Fourier.
Imagerie à super-résolution et analyse de la taille des particules virales du SRAS-CoV-2. A) Une image représentative en super-résolution des virions du SRAS-CoV-2 doublement marqués avec des anticorps primaires anti-spike et anti-nucléoprotéine (N) et des anticorps secondaires marqués respectivement avec Alexa647 (rouge) et Alexa546 (vert). Barre d’échelle 10 µm. B&C) Images agrandies de particules individuelles de SARS-CoV-2 (surlignées dans les cases blanches en A). Barre d’échelle 100 nm. D) Les localisations de super-résolution dans le canal vert (marquant la protéine N) ont été regroupées et chaque groupe a été équipé d’une ellipse pour extraire les dimensions des particules. Un histogramme des longueurs du grand axe équipé d’une fonction gaussienne montre que les virions appartiennent à une seule population, centrée à 143,8 nm. E) L’histogramme du rapport grand/petit axe montre une distribution unique.
Les scientifiques mettent en évidence l’utilité des techniques susmentionnées pour analyser rapidement et en masse les particules virales tout en conservant une haute résolution. Pour montrer davantage l’utilité de leur méthode, ils ont rapidement analysé le virus du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère déjà bien caractérisé (SARS-CoV-2), avec un effet significatif. Cette méthode pourrait être précieuse pour aider à des travaux urgents tels que la purification du virus en identifiant le nombre de virions filamenteux ou en identifiant rapidement la taille et la morphologie afin d’accélérer la production de vaccins.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne devraient pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique/le comportement lié à la santé, ou traités comme des informations établies