La protéine de pointe du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) est responsable de la liaison avec le récepteur de l’enzyme de conversion de l’angiotensine humaine 2 (ACE2) pour faciliter l’entrée dans la cellule hôte, obtenue d’abord par liaison via le domaine de liaison au récepteur et subissant des changements conformationnels ultérieurs qui permettent la fusion membranaire. Le côté cytosolique de ce domaine protéique transmembranaire est riche en cystéine et capable de subir une palmitoylation des protéines, l’addition réversible d’acide palmitique.
Étude : L’inhibition de la palmitoylation de la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 réduit l’infectivité du virus. Crédit d’image : Naeblys/Shutterstock
La palmitoylation est une modification post-traductionnelle courante qui se produit dans plus de 30% de toutes les protéines cellulaires pour favoriser la stabilité des protéines, réguler le trafic membranaire et entreprendre la fusion vésicale. Il a été démontré que la palmitoylation des protéines virales a un impact sur la réplication et la fusion virales, jouant un rôle essentiel dans certains cas.
Par exemple, la protéine de pointe du coronavirus murin doit subir une palmitoylation pour s’assembler et entrer correctement dans les cellules hôtes. De même, des rapports précédents ont démontré que des modifications de la protéine de pointe du SRAS-CoV qui empêche la palmitoylation réduisent également la capacité du virus à provoquer la formation de syncytia.
Dans un article récemment téléchargé sur le serveur de préimpression bioRxiv*, il est démontré que la palmitoylation des cinq premiers résidus cystéine du domaine C-terminal de la protéine de pointe SARS-CoV-2 est essentielle au SARS-CoV-2, facilitant l’entrée des cellules et la formation de syncytia. Les enzymes endogènes facilitent la palmitoylation de la protéine de pointe, et donc l’inhibition de ces enzymes pourrait être une stratégie viable contre COVID-19. Le groupe a également proposé deux candidats-médicaments qui démontrent l’inhibition du SARS-CoV-2 dans la culture cellulaire traitée.
Une version préimprimée de l’étude est disponible sur le site bioRxiv* serveur pendant que l’article est soumis à une évaluation par les pairs.
Le rôle de la palmitoylation
Le domaine riche en cystéine C terminal de la protéine de pointe SARS-CoV-2 porte dix résidus de cystéine hautement conservés. Pour étudier le rôle de la palmitoylation sur ces sites, le groupe les a d’abord échangés avec de la sérine, découvrant que certains des amas de résidus sont plus sujets à la palmitoylation que d’autres.
Il est important de noter que la mutation des grappes avec la plus grande préférence pour la palmitoylation a également dégradé la capacité du lentivirus pseudotypé à pointe SARS-CoV-2 à pénétrer le plus dans les cellules hôtes, soulignant au groupe que les cinq premiers résidus (C1235, 1236, 1240, 1241 et 1243) sont les plus fonctionnellement importants. Cela était vrai pour les interactions entre cellules infectées et cellules non infectées, où la mutation de ces groupes clés a entraîné une réduction marquée de l’activité fusogène et de la formation de syncytia entre les cellules.
Une fois qu’une cellule est infectée, la trimérisation de la protéine de pointe se produit dans la membrane du réticulum endoplasmique des cellules hôtes avant l’assemblage des particules de virion. Le groupe a ensuite comparé les protéines de pointe de type sauvage pleine longueur à celles produites avec des mutations de sérine. Les protéines de pointe mutantes incapables de subir une palmitoylation étaient défectueuses dans la formation de trimère, ce qui explique potentiellement la capacité réduite à entrer dans les cellules hôtes observée.
Contrairement à d’autres bêtacoronavirus, le SRAS-CoV-2 porte également un site de clivage médié par la furine pour faciliter la fusion membranaire de l’hôte, qui s’est avéré non affecté par les mutations imposées par le groupe. De même, l’affinité envers le récepteur ACE2 s’est avérée non affectée par les mutations.
L’infectivité réduite du pseudovirus à protéine de pointe mutée s’est également avérée ne pas être due à une capacité réduite à transporter les particules de virion du réticulum endoplasmique de l’hôte à la membrane plasmique pour une expression vers l’extérieur, car seules les protéines de pointe avec des résidus de cystéine entièrement mutés ont montré une expression moindre, non ceux avec les cinq premiers résidus clés.
Par conséquent, le groupe a établi que la palmitoylation de la chaîne complète de la cystéine est importante pour une bonne trimérisation des pointes, les cinq premiers résidus jouant un rôle moins important à cet égard.
Inhibition de la palmitoylation du SARS-CoV-2
Les enzymes palmitoyl acyltransférase induisent la palmitoylation du groupe thiol des résidus de cystéine, et le groupe a ensuite cherché à identifier l’enzyme responsable de la palmitoylation de la protéine de pointe SARS-CoV-2. Les protéines DHHC5 et DHHC9 ont été inhibées dans les cellules HEK293T à l’aide d’ARNsi, constatant que l’inactivation de la première provoquait une régulation positive compensatrice dans la seconde, qui n’était pas réciproque. Par conséquent, seul le knockdown de DHHC9 a permis de réduire de manière significative la palmitoylation des protéines de pointe dans les cellules infectées.
Les cellules knockdown DHHC9 ont ensuite été exposées à des particules de pseudovirus portant la protéine de pointe SARS-CoV-2, constatant que ces cellules étaient plus résistantes à l’infection et nettement moins susceptibles de s’engager dans la formation de syncytia. Cependant, ces cellules n’étaient pas moins résistantes à l’infection provenant de cellules voisines non traitées avec des protéines de pointe palmitoylées, ce qui implique que la palmitoylation de la protéine de pointe n’est nécessaire que pour l’infection initiale et non pour tout autre événement en aval. Des expériences d’immunofluorescence confirment en outre que DHHC5 localisé avec la protéine de pointe dans le réticulum endoplasmique et Golgi.
Pour tester si l’inhibition médicamenteuse de DHHC9 pouvait réduire l’infectiosité du SRAS-CoV-2, le groupe a assemblé plusieurs inhibiteurs de la palmitoyl acyltransférase qui ont été sélectionnés par ordinateur pour leur affinité. La toxicité d’une sélection de ces composés a été testée dans des cellules HEK293T et Caco-2 et des composés suffisamment tolérés utilisés dans un essai de palmitoylation de pointe SARS-CoV-2.
Deux composés sans nom, appelés composés 13 et 25, se sont avérés inhiber l’infection par le SRAS-CoV-2 en culture cellulaire. Les cellules prétraitées avec l’un ou l’autre des composés et ensuite infectées par le SRAS-CoV-2 ont présenté une réduction dépendante de la dose de la charge virale du SRAS-CoV-2 et une réduction de la taille des syncytia. La descendance virale collectée à partir du surnageant des cellules traitées a ensuite démontré une infectiosité significativement réduite envers les cellules non traitées non infectées, démontrant que la prévention de la palmitoylation pendant la génération de nouvelles particules virales peut altérer leur capacité à infecter de nouvelles cellules hôtes.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique/le comportement lié à la santé, ou traités comme des informations établies.
