Dans une récente étude publiée sur bioRxiv* serveur de préimpression, des chercheurs d’Espagne, du Royaume-Uni et des États-Unis ont utilisé des outils chimiques pour découvrir les détails moléculaires de la modulation médiée par les glycanes du traitement du pic (S) du coronavirus 2 (SARS-CoV-2) du syndrome respiratoire aigu sévère.
Étude : Les sialoglycanes liés à l’O modulent la protéolyse du pic du SRAS-CoV-2 et contribuent à la trajectoire mutationnelle des variantes préoccupantes. Crédit d’image : NIAID
Sommaire
Arrière plan
Le SRAS-CoV-2 S est une glycoprotéine trimérique multidomaine avec une couche de glycane dense. Le site de clivage polybasique (séquences peptidiques riches en arginine) de la furine (FCS) dans le S complet (FL-S) améliore la liaison aux récepteurs de la cellule hôte après avoir été clivé par la furine ou la protéase transmembranaire sérine 2 (TMPRSS2). Le clivage protéolytique amélioré de FL-S en sous-unités S1 et S2 a été attribué au polymorphisme entre les résidus d’acides aminés (AA)/peptides glutamine (Gln)675 et proline (Pro)681 précédant le FCS. Notamment, cette région peptidique du SRAS-CoV-2 S abrite également plusieurs résidus sérine (Ser) et thréonine (Thr) AA qui peuvent porter des glycanes de N-acétylgalactosamine (O-GalNAc). Selon les auteurs, la glycosylation de l’O-GalNAc liée à Ser / Thr a un impact sur le clivage S médié par la furine et TRMPSS2.
Ce tronçon AA est également le plus sujet aux mutations; par la suite, dans les variantes préoccupantes (VOC) Alpha et Delta SARS-CoV-2, plusieurs mutations sont hébergées entre Pro681 en histidine (His) et arginine (Arg), respectivement. Dans toutes les sous-lignées Omicron, y compris BA.1, BA.2 et BA.5, il existe des mutations au niveau de P681H et N679K. Toutes ces mutations ont un effet d’amplification du clivage protéolytique S. C’est un défi analytique d’étudier ce tronçon peptidique dans le SRAS-CoV-2 S en raison de sa complexité biosynthétique et de l’absence de séquence consensus peptidique. De plus, il y a un manque de données sur l’abondance des glycanes, leur(s) site(s) de fixation et leur influence structurelle sur la protéolyse. De plus, les études ont à peine étudié le rôle des mutations COV du SRAS-CoV-2 sur la glycosylation de l’O-GalNAc.
Il existe une famille de 20 isoenzymes GalNAc transférase, GalNAc-T1 à T20 avec différents substrats. L’identification des sites de glycosylation de chaque GalNAc-T pourrait fournir des informations sur la biologie des O-glycanes. Dans une étude précédente de Ten Hagen et al., ils ont trouvé sept isoenzymes qui pourraient introduire GalNAc dans le SARS-CoV-2 S.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont utilisé une tactique d’ingénierie chimique appelée « ingénierie par bosses et trous (BH) » pour étudier les isoenzymes GalNAc-T individuelles dans la cellule vivante. En outre, ils ont insisté sur le fait que l’amélioration du séquençage des glycopeptides basé sur la fragmentation pourrait permettre une analyse améliorée basée sur la spectrométrie de masse (MS).
Premièrement, les chercheurs ont incubé le S recombinant de la souche de type sauvage (WT) du SRAS-CoV-2 avec des constructions P681R (ou P681H) produites dans des cellules Expi293-F humaines avec des versions WT ou BH de GalNAc-T1 ou T2. Ensuite, ils ont procédé au cognement de ces constructions avec du nucléotide-sucre uridine diphosphate (UDP)-GalN6yne. Ils ont marqué les versions glycosylées par cycloaddition d’azide-alcyne catalysée par le cuivre (CuAAC) pour la visualisation via le transfert de streptavidine. Ce traitement a introduit GalN6yne d’une manière spécifique à l’isoenzyme tout en dotant les glycopeptides d’une charge positive supplémentaire qui a facilité l’analyse MS.
a) Modèle et dessin animé du pic SARS-CoV-2. Site de clivage de la furine et alignement peptidique pour les variantes préoccupantes du COVID-19 et les coronavirus apparentés. Surligné en jaune est le motif polybasique du SRAS-CoV-2. En gras et en rouge sont les changements d’acides aminés dans les positions 679 et 681. b) L’ingénierie de bosse et de trou permet le marquage spécifique à l’isoenzyme GalNAc-T des substrats de glycosylation à l’aide du bouton cliquable substrat UDPGalN6yne. FCS = site de clivage de la furine ; COV = variantes préoccupantes.
Ensuite, l’équipe a soumis les sous-unités FL-S et S1/S2 à une digestion en gel et les a analysées par MS en tandem (ETD). Ils ont utilisé la dissociation induite par collision à haute intensité (HCD) pour obtenir des séquences de peptides nus et des compositions de glycanes, puis ont utilisé l’ion diagnostique I-tagged-GalN6yne pour déclencher la fragmentation ETD du squelette peptidique. Les chercheurs ont également validé les résultats de l’étude in vitro. À cette fin, ils ont utilisé la glycosylation de protéines S exprimées de manière recombinante avec des versions solubles de BH-GalNAc-T1 et BH-GalNAc-T2 et CuAAC avec I-tagged-azide et analyse glycoprotéomique MS.
L’équipe a utilisé un panel de peptides synthétiques pour étudier l’effet des mutations de la protéine S sur la glycosylation médiée par GalNAc-T1. Ces peptides présentaient des mutations liées aux COV du SRAS-CoV-2 aux principaux points chauds : Gln675, Gln677, asparagine (Asn)679 et Pro681.
La glycosylation module le traitement protéolytique du S en fonction de la distance au site de clivage et de la composition des glycanes. Ainsi, l’équipe a directement sondé si les glycanes O-GalNAc sur Thr678 modulaient le clivage du S par la furine à l’aide de peptides substrats actifs synthétiques Förster Resonance Energy Transfer (FRET). Les peptides couvrant les résidus Gln 672 à 689 contenaient du 2-aminobenzoyle N-terminal et du 3-nitro-Tyr C-terminal comme fragments donneur de fluorescence et extincteur, respectivement. Une augmentation de l’intensité de la fluorescence indique un clivage du S médié par la furine. Tout d’abord, ils ont comparé des substrats non glycosylés correspondant à la pointe mutante WT (FRET-1) et P681H (FRET-2). De plus, ils ont soumis TMPRSS2 recombinant à des substrats glycopeptidiques FRET FRET-1, FRET-3 et FRET-7 à FRET-9.
Résultats de l’étude
La validation informatique et manuelle a révélé que Thr678 portait GalN6yne modifié par étiquette I dans les échantillons FL-S et S1 uniquement dans les cellules exprimant BH-T1. La thréonine (Thr)323 glycosylée BH-T1 et BH-T2 n’avait été associée à aucune isoenzyme GalNAc-T. L’analyse FRET a révélé que l’élaboration de glycanes O-GalNAc sur Thr678 de la glycoprotéine SARS-CoV-2 S, en particulier avec des modifications chargées négativement, a gravement entravé l’activité de la furine. Les O-glycanes dans les cellules épithéliales pulmonaires exprimant GalNAc-T1 suggèrent que la glycosylation est une modification physiologiquement significative qui limite la maturation de la protéine S au cours de l’évolution.
Selon les auteurs, la perturbation de la glycosylation de l’O-GalNAc a été un moteur majeur de l’évolution des COV du SRAS-CoV-2. Dans la trajectoire évolutive du SRAS-CoV-2 Alpha aux COV Delta et Omicron, des changements notables dans les séquences AA précédant le FCS ont indiqué que le clivage protéolytique s’améliorait progressivement avec l’augmentation de l’infectivité des COV. La mutation analogue trouvée sur le Delta VOC plus transmissible (P681R) a également été liée à une augmentation du clivage de la furine, suggérant une trajectoire évolutive qui supprime l’O-glycosylation avant d’augmenter la reconnaissance intrinsèque de la furine.
Contrairement à P681H détecté dans les premières variantes telles que Alpha, la mutation N679K dans Omicron n’a pas eu d’impact substantiel sur la glycosylation mais a conduit à un clivage accru de la furine des peptides synthétiques. Ces mutations FCS-proximales ont agi en synergie et ont évolué pour supprimer la glycosylation et améliorer le clivage de la furine.
conclusion
L’étude actuelle a établi que l’O-glycosylation est un déterminant clé du clivage et de la maturation du SRAS-CoV-2 S. Il pourrait également s’agir d’un vestige de souches ancestrales de SRAS-CoV-2 perdues par l’évolution virale.
Les chercheurs ont mis en évidence que GalNAc-T1 a amorcé la glycosylation à Thr678 dans les cellules vivantes. Le site de glycosylation à Thr678 du S (non proche du FCS) expliquait pourquoi un seul résidu GalNAc était insuffisant pour moduler l’activité de la furine et n’affectait que légèrement l’activité de TMPRSS2. Au contraire, l’élaboration et la sialyation ont supprimé l’activité de la furine jusqu’à 65 %. De même, la O-glycosylation a eu un impact négatif sur le clivage du S par TMPRSS2, les O-glycanes contenant le disaccharide du noyau 1 (Galβ1-3GalNAc-) ayant le plus d’effet. Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont souligné la nécessité de techniques de traçage des glycanes plus avancées pour étudier l’évolution du SRAS-CoV-2.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
