La pandémie mondiale actuelle de coronavirus 2019 (COVID-19) est causée par le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2). La pandémie de COVID a été décrite par l’Organisation mondiale de la santé (OMS) comme une urgence de santé publique de portée internationale.
À ce jour, plus de cinq millions de décès ont été signalés en raison de COVID-19, et ce nombre est considéré comme une sous-estimation en raison du manque de capacité de test dans les régions en développement du monde.
Outre l’approche plus conventionnelle de la réaction en chaîne de la polymérase (PCR), des tests immunologiques ont été utilisés pour détecter les virus. De plus, des techniques basées sur la spectrométrie de masse (MS) ont été utilisées pour la détection des protéines virales de la grippe et du métapneumovirus humain (HMPV) dans des échantillons cliniques. Une augmentation substantielle a été observée grâce aux développements récents des méthodes de protéomique ciblée et de la spectrométrie de masse Orbitrap, telles que la surveillance des réactions parallèles (PRM). Plusieurs études sur le SRAS-CoV-2 ont utilisé des approches MS, mais il n’est pas encore clair si les technologies protéomiques de pointe pourraient fournir la sensibilité et la spécificité nécessaires pour des diagnostics définitifs.
Une équipe de chercheurs de diverses institutions aux Pays-Bas a examiné l’utilisation de la protéomique ciblée basée sur la SEP pour la détection du SRAS-CoV-2 dans des échantillons de recherche et cliniques. Les auteurs ont d’abord analysé la limite de détection des PRM sur un spectromètre de masse Orbitrap pour des peptides trypsiques spécifiques des protéines SARS-CoV-2. Les auteurs ont ensuite testé la sensibilité de cette méthode pour la détection du SRAS-CoV-2 dans des échantillons cliniques, tels que des écouvillonnages nasopharyngés, des expectorations et du mucus.
Cette étude est publiée dans le PLOS Un journal.
L’étude
Les auteurs ont utilisé la protéomique ascendante standard pour analyser le protéome global des cellules Vere E6 infectées par le SRAS-CoV-2. Cette méthode de protéomique ciblée a ensuite été utilisée pour détecter les protéines du SRAS-CoV-2 dans des échantillons de patients COVID-19. En raison de toute infectivité virale dans les échantillons devant être abolie dans un laboratoire de niveau de biosécurité trois (BSL-3) avant tout autre traitement, l’état du matériel de départ n’a pas été optimisé pour la protéomique ultérieure.
Le test PRM pour la première cohorte de patients avait des intensités de pic spectral de masse relativement élevées pour les divers peptides cibles dans tous les échantillons. En outre, les protéines virales pourraient toujours être détectées sans ambiguïté, même dans plusieurs échantillons avec des valeurs de seuil de cycle (Ct) dans la vingtaine. Par exemple, l’un des échantillons de peptides (peptide n°5) GQGVPINTNSSPDDQIGYYR a été identifié par huit ions fragments de masse très précise. Entre les caractéristiques de l’échantillon, il existe une relation inverse claire, avec une valeur seuil pour la détection via la spectrométrie de masse ciblée se situant autour d’une valeur Ct de 22.
La deuxième cohorte d’échantillons de patients était composée de quinze écouvillonnages nasopharyngés prélevés sur des patients positifs au COVID-19. Encore une fois, les auteurs ont mené une SEP positive, qui a révélé tous les patients avec des valeurs de Ct supérieures à 24, même si les intensités totales absolues des fragments peptidiques cibles affichaient une grande variation. Étonnamment, différents ensembles de peptides cibles ont été plus fortement détectés dans plusieurs échantillons de patients, même si chaque échantillon a été préparé exactement de la même manière, en suivant le même protocole. Cela pourrait être dû à l’hétérogénéité de l’échantillon, qui peut avoir causé divers résultats de la digestion des protéines.
Pour obtenir une sensibilité plus élevée et réduire le temps global d’analyse MS par chromatographie liquide, les auteurs ont testé deux procédures expérimentales différentes. Premièrement, ils ont appliqué un fractionnement en phase inversée à pH élevé à des digestions trypsiques d’échantillons cliniques pour augmenter la mesure de la sensibilité. Deuxièmement, les peptides fractionnés ont été collectés en huit fractions, qui ont été analysées séparément par PRM MS. Cette procédure a entraîné dans certains cas une meilleure détection des peptides et des valeurs de quantification plus élevées.
Dans les échantillons fractionnaires, les abondances de peptides étaient jusqu’à cinq fois plus élevées, tandis que la quantification absolue basée sur la comparaison avec les quantités estimées de peptides homologues AQUA a montré que les peptides du SRAS-CoV-2 pouvaient être détectés dans la plage attomolaire basse à moyenne. . Il y avait des identifications et des résultats de quantification réduits avec un gradient MS de chromatographie liquide plus court. Bien que des niveaux extrêmement faibles de peptides cibles puissent encore être identifiés et quantifiés, même avec la présence accrue de pics contaminants qui étaient très probablement dus à des spectres de masse plus encombrés.
Implications
Les niveaux de sensibilité actuels de la méthodologie de la protéomique PRM et l’identification réussie des protéines du SRAS-CoV-2 dans les échantillons cliniques permettent l’exploration de la spectrométrie de masse en tant que méthode pour les laboratoires cliniques et de diagnostic pour détecter les infections au SRAS-CoV-2 dans les échantillons cliniques.
Les recherches futures sur ces méthodes devraient se concentrer sur l’optimisation des procédures de préparation rapide des échantillons et le débit de la chromatographie liquide et de la spectrométrie de masse.