Dans une récente étude publiée sur bioRxiv* serveur de préimpression, les chercheurs ont évalué l’impact du ciblage de Neu1 intracellulaire sur l’infection par le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2).
Il est urgent de développer des traitements contre la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) et des antiviraux contre le SRAS-CoV-2. De plus, des études montrent que les nouvelles mutations du SRAS-CoV-2 sont moins résistantes aux vaccinations actuelles. Par conséquent, pour créer des médicaments thérapeutiques, il est essentiel de comprendre les mécanismes de pathogénicité du SRAS-CoV-2 et la réponse de l’hôte.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont démontré que l’hôte Neu1 contrôlait la sialylation de la protéine de nucléocapside du coronavirus, régulant ainsi la réplication du coronavirus.
L’équipe a utilisé la spectrométrie de masse pour étudier les N- et O-glycanes sur la protéine de la nucléocapside (N) du coronavirus humain OC43 (HCoV-OC43), un bêta-coronavirus qui provoque de légers symptômes respiratoires. Un transfert de lectine a été réalisé à partir d’échantillons immunoprécipités à partir du sérum de patients infectés par le SRAS-CoV-2 et de témoins sains, ainsi que de lysats cellulaires infectés par HCoV-OC43 et traités avec des anticorps anti-protéine N.
Le blot de lectine a déterminé si la sialylation s’est produite sur la protéine N correspondant au coronavirus HCoV-OC43 et SARS-CoV-2. Les échantillons immunoprécipités ont été soumis ou non à un traitement à la sialidase avant de subir une séparation par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE).
L’équipe a étudié comment la sialylation sur la protéine N pourrait avoir un impact sur sa capacité à se lier à l’acide ribonucléique (ARN). Des tests de liaison aux acides nucléiques ont été effectués avec un ARN simple brin (ARNsb) à motif tige-boucle II (32m) 32-mères et son imitateur d’acide ss-désoxyribonucléique (ADN) 32-mers pour évaluer l’affinité de liaison aux acides nucléiques de N protéine. Les cellules HEK293T ont été lysées 48 heures après la transfection du vecteur d’expression de la protéine SARS-CoV-2 N.
Par la suite, les cellules ont été administrées avec ou sans sialidase pour des expériences de liaison d’acide nucléique. À l’aide de lignées cellulaires THP-1, l’équipe a évalué le rôle des sialidases endogènes dans la sialylation de la protéine N.
L’équipe a évalué comment la sialylation pourrait avoir un impact sur la réplication virale. La réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (RT-qPCR) a été utilisée pour mesurer l’infection virale à l’aide d’amorces ciblant la région codante du gène N viral. Après la provocation virale, l’ARN cellulaire a été collecté aux moments désignés et les transcrits viraux ont été mesurés. De plus, les surnageants ont subi un traitement pour le test de dose infectieuse de culture tissulaire à 50 % (TCID50), qui a été utilisé pour mesurer le titre de virus.
Résultats
Les résultats de l’étude ont montré que bien que la glycosylation des liaisons N et O ait été observée sur la protéine N in vitro système surexprimé, on ne sait pas si la protéine N du virion est glycosylée ou non. Les protéines de la pointe (S), de l’enveloppe (E) et de la membrane (M) du SARS-CoV-2 sont toutes glycosylées. La protéine N était significativement sialylée dans les cellules des patients infectés par le COVID-19 et le HCoV-OC43. La majeure partie de l’acide sialique sur la protéine N était attachée dans des liaisons alpha-2, 6, tandis que le traitement à la sialidase vérifiait la sialylation de la protéine N. Une protéine SARS-CoV-2 N exprimée dans les cellules HEK293T, la protéine HCoV-OC43-N exprimée dans les cellules THP-1 et le virion HCoV-OC43 se sont tous avérés sialylés.
En présence d’anticorps anti-protéine N, une protéine SARS-CoV-2 N a formé un puissant complexe avec un ARNss 32-mer et un ADNss 32-mer qui a été superdécalé, démontrant que ce complexe était exclusif à la protéine N. Comme prévu, les lysats de cellules HEK293T transfectées avec un vecteur vide n’ont pas réussi à se lier à l’ARNss et à l’ADNss 32-mer. De plus, la quantité d’ADNsb et d’ARNss 32-mères liés à la protéine N après le traitement à la sialidase a augmenté de manière significative. Ces résultats ont corroboré la fonction cruciale de la sialylation de la protéine N dans la liaison de l’ARN en montrant une augmentation considérable de l’activité de liaison de l’ARN de la protéine N après un traitement à la sialidase.
Après avoir été infecté par HCoV-OC43 pendant 72 heures, l’expression de Neu1 était considérablement élevée, mais pas de Neu2, Neu3 ou Neu4, selon la PCR en temps réel et les analyses Western blot. Notamment, les patients atteints de COVID-19 avaient également régulé à la hausse Neu1. De plus, dans les cellules infectées par HCoV-OC43, la protéine N était associée à Neu1.
Deux jours après la provocation virale, la réplication de HCoV-OC43 était plus de 10 fois supérieure dans les surnageants de culture cellulaire de cellules qui surexprimaient Neu1 par rapport aux cellules qui exprimaient des vecteurs vides au niveau des transcrits viraux et des titres viraux. En revanche, la réplication de HCoV-OC43 était plus de 100 fois plus faible dans les cellules qui surexprimaient l’ARN en épingle à cheveux court (shRNA) pour Neu1 que celles qui exprimaient le shRNA brouillé, à la fois en termes de transcrits viraux et de titres viraux.
Conformément à l’efficacité de knockdown du shRNA, Neu1sh3 a considérablement réduit la réplication de HCoV-OC43 plus que Neu1sh1 et Neu1sh2. Les niveaux de protéine N étaient également sensiblement plus élevés dans les cellules surexprimant Neu1 que dans les cellules neutralisées Neu1. Ces résultats suggèrent que l’hôte Neu1 contrôle la réplication de HCoV-OC43 dans les cellules THP-1. La protection la plus efficace a été fournie par Neu5Ac2en-OAcOMe, tandis que les inhibiteurs de la neuraminidase virale Zanamivir et oseltamivir ont affiché une faible activité inhibitrice. Ces résultats ont corroboré des rapports antérieurs selon lesquels le zanamivir et l’oseltamivir ont une faible activité de sialidases anti-humaines.
La provocation HCoV-OC43 a entraîné la mort de toutes les souris traitées avec le véhicule, mais seulement 50 % des animaux traités avec Neu5Ac2en-OAcOMe ont survécu à toute la période d’observation. Par rapport aux souris traitées avec Neu5Ac2en-OAcOMe, les souris traitées avec le véhicule avaient un poids corporel considérablement inférieur. Les souris traitées avec Neu5Ac2en-OAcOMe ont également réduit la réplication virale HCoV-OC43 dans le sang, le cerveau et les poumons.
Les résultats de l’étude ont montré qu’un inhibiteur de la sialidase nouvellement développé, Neu5Ac2en-OAcOMe, ciblait sélectivement la sialidase Neu1 de l’hôte intracellulaire et supprimait la réplication du coronavirus, expliquant les rôles de l’hôte ainsi que de l’agent pathogène dans la manifestation de la maladie.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
