Une étude récente publiée sur bioRxiv* le serveur de préimpression a discuté des résultats d’une analyse mutationnelle complète de la protéase principale (Mpro) du coronavirus-2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2).
Étudier: Le paysage complet de la condition physique du SRAS-CoV-2 Mpro révèle des informations sur les mécanismes de résistance virale. Crédit d’image : Kateryna Kon/Shutterstock
La pandémie de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) a provoqué une crise sanitaire et économique sans précédent dans le monde entier, perturbant la vie normale. Divers types de médicaments ont été initialement réutilisés pour traiter le COVID-19 avant l’avènement des vaccins contre le SRAS-CoV-2. Jusqu’à présent, plus de huit milliards de doses de vaccins COVID-19 ont été administrées. Malgré cela, les infections continuent d’augmenter massivement dans de nombreux pays dominés par la variante Omicron récemment apparue.
Bien que plusieurs médicaments antiviraux et anticorps monoclonaux contre le SRAS-CoV-2 soient utilisés dans le traitement du COVID-19, le Mpro, également connue sous le nom de protéase 3CL, est devenue une cible médicamenteuse prometteuse avec plusieurs médicaments en préparation. Mpro clive les deux polyprotéines (pp1a et pp1ab) du SRAS-CoV-2, indispensables au cycle de vie viral chez l’hôte.
Sommaire
L’étude
Dans la présente étude, les auteurs ont effectué une analyse mutationnelle complète du SARS-CoV-2 Mpro et analysé les fonctions de toutes les mutations ponctuelles résultant en des substitutions d’acides aminés simples. Les chercheurs ont développé trois cribles orthogonaux à haut débit dans la levure pour distinguer fonctionnellement Mpro. Mpro est exprimé en ubiquitine (Ub)- Mpro la protéine de fusion et Ub est ensuite clivée. Mpro l’expression était inductible par le β-estradiol sous le contrôle étroit et précis du facteur de transcription LexA-ER-AD. La protéine bactérienne de liaison à l’ADN LexA, le récepteur des œstrogènes humains (ER) et le domaine d’activation B112 constituent la construction LexA-ER-AD. Pour contrôler l’expression de Ub- Mpro, 4 séquences de liaison à l’ADN LexA (boîtes LexA) ont été placées en amont de Ub-Mpro.
Dans le premier écran, le Mpro l’activité a été mesurée par la perte de transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) dans la séquence coupée Nsp4/5 flanquée des deux côtés par des protéines fluorescentes. La deuxième méthode de dépistage est la même que la première basée sur la perte de FRET, mais le facteur de transcription pour l’expression de la protéine fluorescente verte (GFP) est inactivé par l’activité protéase de Mpro. Le dépistage final est basé sur le Mpro toxicité pour les cellules de levure diminuant la croissance des levures. Après avoir sélectionné les mutations dans les trois écrans, une analyse de séquençage approfondie a été effectuée pour quantifier les fonctions en fonction de l’enrichissement ou de l’épuisement de chaque Mpro une variante.
Résultats
Dans le premier écran, la perte de FRET a été mesurée par tri unicellulaire activé par fluorescence (FACS) en raison de la Mpro expression dépendante du β-estradiol. Une substitution d’acides aminés (C145A) au site catalytique n’a pas réussi à reproduire l’effet antérieur de la perte de FRET indiquant que le changement de signal de FRET nécessite un M catalytiquement fonctionnelpro.
Dans le deuxième test de dépistage, les domaines de liaison à l’ADN et d’activation du facteur de transcription Gal4 flanquaient le site de clivage Nsp4/5 et l’inactivation d’un facteur de transcription par un M fonctionnelpro réduit l’expression de la GFP d’une manière dépendante du β-estradiol. Mpro est toxique pour les cellules de levure probablement en raison de son activité protéasique. La croissance des levures varie avec la concentration de β-estradiol qui induit Ub-Mpro et un M élevépro l’expression est corrélée négativement avec la croissance de la levure. Les auteurs ont effectué une analyse mutationnelle systématique et intégré les trois tests de dépistage pour déterminer l’impact fonctionnel de chaque mutation ponctuelle sur des sites individuels dans Mpro et chaque site a été remplacé par 19 acides aminés et un codon d’arrêt.
Les mutations C145 et H41 au niveau de la dyade catalytique essentielle ont rendu un M fonctionnellement inactifpro. L’équipe a trouvé environ 24 sites qui avaient une faible tolérance aux mutations et seulement quatre d’entre eux (C145, H41, H163 et D187) avaient un contact direct avec le substrat. Les 24 sites se sont avérés hautement conservés parmi les homologues du SRAS-CoV-2 et des sites comme G143, H163, D187 et Q192 étaient très sensibles aux mutations, mais les sites M49, N142, E166 et Q189 étaient très tolérants aux mutations. Les résultats ont révélé que les mutations N142, E166 et Q189 étaient compatibles avec Mpro fonctionnent et ont proposé que ces sites extrêmement tolérants aient un potentiel élevé de développer ou d’évoluer une résistance aux inhibiteurs/médicaments. Il a été observé que trois mutations Q189E, E166A et E166Q pourraient avoir une résistance potentielle contre le Mpro inhibiteur PF-07321332, qui est le médicament approuvé par Pfizer.
conclusion
Dans cette étude, l’équipe a utilisé des tests de dépistage de levure et les a intégrés à la numérisation mutationnelle pour identifier les mutations avec l’impact fonctionnel qui a abouti à l’identification d’emplacements sensibles et tolérants aux mutations au sein de Mpro. De plus, les auteurs ont trouvé des substitutions qui avaient le potentiel d’induire une résistance contre le M approuvé par la FDApro inhibiteur, PF-07321332.
En conclusion, les résultats de la présente étude peuvent guider le développement de Mpro les médicaments inhibiteurs qui sont moins vulnérables à la résistance, en favorisant les interactions médicament-protéine au niveau des sites sensibles aux mutations et en évitant les résidus tolérants aux mutations.
Bien que ces résultats soient prometteurs, l’étude a été réalisée sur un seul Mpro site de clivage sur 11 sites de clivage et des recherches supplémentaires sont nécessaires sur les autres sites de clivage pour comprendre complètement les pressions de sélection sur Mpro.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
