Dans une étude récente publiée dans Natureles chercheurs développent le système de séquençage de répétitions palindromiques courtes et régulièrement espacées (CRISPR)-organoïdes humains-acide ribonucléique (ARN) unicellulaire (CHOOSE) pour identifier les anomalies du développement cérébral dans l’autisme.
Étude: Le dépistage des organoïdes cérébraux unicellulaires identifie les défauts de développement dans l’autisme. Crédit d’image : Yurchanka Siarhei/Shutterstock.com
Sommaire
Diagnostiquer l’autisme
Le trouble du spectre autistique (TSA) est une maladie neurodéveloppementale définie par des perturbations des processus de développement du cerveau humain, qui sont influencés par la programmation génétique et moléculaire. En raison de la complexité du développement cérébral, le diagnostic de l’autisme peut être retardé.
Malgré les difficultés du dépistage des perturbations unicellulaires, la compréhension de l’étiologie génétique des troubles neurodéveloppementaux (NDD) nécessite un accès aux processus de développement du cerveau humain.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs décrivent le système CHOOSE, qui intègre des changements héréditaires parallèles dans l’affichage transcriptomique unicellulaire au sein des organoïdes cérébraux en mosaïque afin d’identifier les traits dysfonctionnels des gènes de troubles du spectre autistique à haut risque dans différents types de cellules aux premiers stades de développement cérébral dans le cerveau. organoïdes.
Pour le dépistage groupé des pertes de fonction dans les organoïdes en mosaïque, la méthode CHOOSE utilise des molécules d’ARN guides, de courtes répétitions palindromiques inductibles regroupées régulièrement espacées, une perturbation génomique basée sur la protéine 9 (Cas9) associée à CRISPR et des analyses transcriptomiques unicellulaires.
Des paires d’ARN guide à code-barres (ARNg) ont été fournies aux cellules souches sous forme de bibliothèques lentivirales regroupées. Des organoïdes télencéphaliques ont été produits pour détecter les caractéristiques dysfonctionnelles de 36 gènes associés à un risque accru de TSA au niveau du type cellulaire et des voies moléculaires.
Un réseau de régulation génétique organoïde cérébral (GRN) a été construit pour découvrir les centres de régulation enrichis par l’autisme liés à des gènes dysfonctionnels en raison de perturbations génétiques. Le criblage CRISPR unicellulaire a été réalisé dans des organoïdes à code-barres.
À l’aide des scores génétiques de la Simons Foundation Autism Research Initiative (SFARI), les chercheurs ont étudié les symptômes de perte de fonction de 36 gènes régulateurs transcriptionnels avec une probabilité causale élevée de TSA.
Un transfert d’étiquettes a été utilisé pour générer des étiquettes de type cellulaire pour l’ensemble de données CHOOSE complet. Les phénotypes de prolifération et d’épuisement cellulaires ont été examinés et les effets spécifiques au type de cellule des perturbations du gène TSA ont été analysés à l’aide du test Cochran-Mantel-Haenszel (CMH) stratifié par répétitions de bibliothèque. Pour examiner plus en détail les altérations moléculaires générées par chaque perturbation, une étude différentielle de l’expression génique a été menée.
Des études de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et d’immunohistochimie (IHC) ont également été réalisées. Les modules de régulation associés aux TSA et les variations documentées de l’expression des gènes dans le télencéphale dorsal et ventral ont été déterminés pour chaque perturbation génétique.
Des modules de facteurs de transcription (TF) associés aux TSA tout au long du développement cortical, ainsi que d’importants centres de régulation qui sous-tendent les altérations de l’expression génique observées, ont également été identifiés.
Toutes les expériences ont été réalisées en utilisant des cellules souches embryonnaires humaines (hES) exprimant eCas9. Des tests d’ARN guide basés sur la cytométrie en flux ont été utilisés pour mesurer l’efficacité de l’édition de paires d’ARN à guide unique (sgRNA).
Deux patients présentant des mutations hétérozygotes de la protéine 1B (ARID1B) contenant un domaine interactif riche en AT ont été recrutés pour confirmer la pertinence des résultats pour les maladies humaines. Les structures cérébrales fœtales ont été étudiées par imagerie par résonance magnétique (IRM).
Résultats de l’étude
L’étude visait à déterminer l’impact des TSA sur les organoïdes, avec un accent particulier sur la perturbation de 36 gènes associés à un risque accru de troubles du spectre autistique. Des corps embryonnaires en mosaïque ont été générés à l’aide d’une technologie de criblage de codes-barres regroupée et de haute complexité, qui a ensuite été utilisée pour construire des corps embryonnaires en mosaïque.
La mutation du composant BRG1/BRM-associated factor (BAF) dans le gène ARID1B a influencé la transition des progéniteurs vers des cellules de type précurseur d’interneurone et des oligodendrocytes, ce qui a été validé dans des organoïdes cérébraux induits par le patient et obtenus par des cellules souches pluripotentes. Le système CHOOSE a été utilisé pour étudier l’impact de nombreux gènes TSA sur le sort des cellules.
Les résultats ont confirmé les phénotypes d’enrichissement et d’épuisement dans les organoïdes individuellement perturbés pour quatre gènes, dont la lysine N-méthyltransférase 2C (KMT2C), l’homologue LEO1, le composant complexe Paf1/ARN polymérase II (LEO1), la protéine neuroprotectrice dépendante de l’activité (ADNP) et le domaine WW. -contenant la protéine adaptatrice (WAC).
Les cellules du criblage CHOOSE proviennent d’une variété de minuscules clones, ce qui est essentiel pour minimiser les effets clonaux dominants. La pathologie associée aux TSA peut apparaître dès le stade progéniteur neural.
L’attachement cellulaire, la différenciation cellulaire, la croissance du cerveau antérieur et l’axogenèse figuraient parmi les processus biologiques les plus liés après la perturbation du gène TSA. L’étude de l’approximation et de la projection du collecteur uniforme (UMAP) a identifié des groupes TF distincts qui sont actifs dans les cellules progénitrices du cerveau, les neurones inhibiteurs et les neurones excitateurs. La concentration de facteur de transcription oligodendrocytaire 1 (OLIG1) et d’éomésodermine (EOMES) en réponse aux altérations génétiques des TSA suggère des réseaux de régulation potentiellement sensibles liés à la spécification du destin cellulaire.
Une voie de développement distincte allant des cellules progénitrices ventrales aux cellules précurseurs des oligodendrocytes (OPC) précoces a été découverte, ainsi que des cellules précurseurs d’interneurones ramifiées (INP) dans divers neurones inhibiteurs. Les cellules déficientes en ARID1B étaient concentrées dans la trajectoire des cellules précurseurs des oligodendrocytes avec de nombreuses cellules gliales radiales ventrales OLIG2+ (v-RGC). Les v-RGC affectés par ARID1B présentaient de plus grandes chances de transition vers des cellules précurseurs d’oligodendrocytes précoces par rapport aux destins neuronaux.
Conclusions
Les résultats de l’étude soulignent l’importance de comprendre l’impact des TSA sur les organoïdes et la fonction possible de ces gènes dans la détermination du destin cellulaire. Le système CHOOSE, qui fournit une base de données spécifique au développement et au type de cellule pour les études sur la perte de fonction des gènes, a été utilisé pour examiner les TSA chez les organoïdes.
Ces observations démontrent que les CIP sont plus sensibles aux altérations génétiques des TSA, les neurones excitateurs L2/3 étant particulièrement vulnérables. Le module OLIG1, nécessaire au développement des oligodendrocytes, est également impliqué dans la physiopathologie des TSA.
