Croissance, adaptation et neutralisation du SRAS-CoV-2 avec du sérum en phase aiguë

La pandémie de COVID-19 causée par le syndrome respiratoire aigu sévère coronavirus 2 (SRAS-CoV-2) a stimulé des recherches intensives sur divers aspects de l'infection virale, de l'adaptation et de la pathogenèse. Une étude récente par des chercheurs de l'Université de Pittsburgh et publiée sur le serveur de préimpression bioRxiv * en juin 2020 rapporte les résultats de la croissance et de la caractérisation du virus, ainsi que le développement d'anticorps neutralisants dans le sérum de patients hospitalisés infectés de façon aiguë par COVID-19.

Le virus du SRAS-CoV-2 se lie aux récepteurs ACE2 sur une cellule humaine, le stade initial de l'infection au COVID-19. Crédit d'illustration: Kateryna Kon / Shutterstock

Le génome viral code pour les protéines structurelles et non structurales. Parmi eux se trouvent la nucléocapside (N), la pointe (S), la membrane (M), l'enveloppe (E) et diverses protéines accessoires. Ceux-ci ont diverses fonctions, la capside virale étant composée principalement de protéine N, qui contribue également à la réplication virale, à la transcription et à l'assemblage viral. Il produit également des changements adaptatifs dans l'environnement de la cellule hôte.

La protéine S est une protéine de fusion qui assure la liaison virale au récepteur ACE2 humain sur la membrane cellulaire, ce qui déclenche la fusion de la membrane des cellules virales pour faciliter l'entrée virale dans le cytoplasme. Deux étapes de clivage sont essentielles pour que cela se produise.

Les enzymes de clivage sont généralement fournies par la cellule hôte, et donnent naissance à la protéine S1 qui est responsable de l'attachement viral, et donnent naissance à la protéine S2, qui assure la fusion après un traitement ultérieur. Certains coronavirus sont amorcés par clivage lors de la synthèse virale dans la cellule infectée. Cependant, la protéine S du SRAS-CoV-2 n'est clivée qu'après que la première génération de virus répliqués de la cellule infectée s'est attachée à la cellule suivante et y est entrée.

Croissance et caractérisation du virus. (A et B) Images représentatives montrant des plaques générées par l'infection de cellules Vero-E6 avec différents passages des stocks de virus Wash1 (A) et Munich (B). Les chromatogrammes sous chaque image de plaque montrent la séquence nucléotidique codant pour la région du signal de clivage de la furine (RRAR) de la protéine S pour chaque passage de virus. Les lignes rouges et noires indiquent les sous-unités putatives S1 et S2, respectivement, générées après le clivage. Les lignes grises indiquent le triplet de nucléotides codant pour S 686.

Variété de protéases

Il existe une variété de protéases qui clivent la protéine S dans différents contextes, telles que les proprotéines convertases, les protéases de surface cellulaire ou les protéases lysosomales et les furines, selon le moment du clivage des pointes. Les furines agissent pendant le conditionnement du virus, les élastases après la libération du virus, l'enzyme TMPRSS2 après la fixation du virus et la cathepsine L après l'endocytose virale pour pénétrer dans la cellule hôte.

La protéine SARS-CoV-2 S a une nouvelle insertion à l'interface S1 / S2, qui n'est pas observée dans le virus du réservoir de chauve-souris, et cela est censé signaler un signal de clivage de la furine. Les chercheurs ont constaté que le clivage de la furine est nécessaire pour faciliter l'entrée du pseudovirus exprimant la protéine SARS-CoV-2 S dans d'autres lignées cellulaires qui expriment le récepteur ACE2 humain, et pour l'infection des cellules pulmonaires humaines par le virus SARS-CoV-2 .

La protéine S est une cible privilégiée pour le développement de vaccins et pour la réponse naturelle des anticorps neutralisants. La plupart des lymphocytes T CD4 et CD8 sont dirigés contre les protéines S, M et N.

Caractérisation virologique et immunologique

La présente étude visait à analyser les isolats viraux de deux patients, en termes de caractéristiques virales et de réponse immunologique, ainsi qu'à observer les changements dans le génotype du site de clivage de la furine après passage à travers la culture cellulaire Vero. Les chercheurs ont également recherché des changements dans la réponse des anticorps neutralisants aux changements de séquence génétique dans cette région.

Enfin, ils ont examiné le titre d'anticorps de neutralisation dans des échantillons en série dans l'infection aiguë au COVID-19. L'étude porte ainsi sur des inconnues importantes dans la standardisation des souches virales, l'interaction entre les cellules in vitro, la pathogenèse de la maladie et les meilleures souches pour les tests de vaccins et de médicaments.

Mutations et conséquences

Les deux souches de virus sélectionnées pour le passage représentaient des isolats européens et américains. Les chercheurs ont découvert, tout d'abord, que l'isolat américain Wash1: P6 (passage 6) avait une mutation de suppression dans la séquence codant le signal de clivage de la furine de la protéine S, mais que cela n'a pas été trouvé dans la souche de passage 4 reçue à l'origine ou après la passage suivant, dans la souche P5. Cela indique, disent-ils, que « une fois qu'une suppression se produit, elle est rapidement sélectionnée dans les cellules Vero et enrichie dans la population virale ».

La suppression était associée à une augmentation du titre viral de P5 (non supprimé) à P6 (supprimé), tandis que l'autre souche (Munich) avait une réduction du titre de P2 à P3, sans mutation discernable. Des taux de croissance accrus et des titres viraux plus élevés sont généralement associés à des adaptations réussies à la culture cellulaire.

Les chercheurs expliquent cette découverte en termes d'études antérieures qui montrent que l'entrée du pseudovirus dans ces cellules est améliorée après la suppression de ce signal et que l'entrée dépendante de TMPRSS2 du SRAS-CoV-2 dans les cellules pulmonaires humaines en culture est médiée par un clivage médié par la furine . L'absence de l'enzyme de clivage TMPRSS2 dans les cellules Vero signifie que l'entrée du virus dans celles-ci est médiée par la cathepsine, ce qui signifie que le signal de clivage de la furine n'est pas requis pour ce virus passé. Ensemble, cela signifie que la séquence supprimée peut avoir été contre-productive à l'entrée virale, expliquant le succès du mutant de délétion.

Deuxièmement, les résultats observés indiquent qu'une augmentation des titres du SRAS-CoV-2 d'environ 1 log signifie une adaptation réussie aux conditions de culture.

Les chercheurs ont observé quatre changements de nucléotides simples provoquant un changement dans la séquence d'acides aminés, dans plus de 25%, dans le gène S de l'isolat de Munich par rapport au Wash1. L'un d'entre eux, le D614G, est devenu bien connu en tant que mutation qui devient rapidement prédominante dans la localité où il est introduit et a donc été considéré comme augmentant la transmissibilité virale. Il peut également permettre une entrée plus efficace du virus dans les cellules qui expriment l'ACE2 humaine, comme indiqué dans une étude de pseudotype rétroviral.

Une autre mutation, S686G, a été découverte pour la première fois dans le séquençage P2, à l'emplacement supposé être l'interface S1 / S2. Il est devenu plus courant après le passage et peut former l'extrémité N-terminale de la sous-unité S2 après le clivage S. Ce résidu sérine devrait également être l'un des sites de glycosylation liée à l'O, qui est à son tour dû à l'insertion de cinq résidus de proline en amont. Une autre mutation observée ici est T941P, qui peut déstabiliser la structure post-fusion.

Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour savoir si, comme dans d'autres virus, la mutation S686G affecte le clivage via la furine, si la sérine est réellement glycosylée et les conséquences biologiques.

Échec de clivage

Les chercheurs ont également observé que même avec des signaux de clivage de la furine intacts, la protéine S n'a pas subi de clivage, ce qui correspond à d'autres études utilisant du sérum humain. Ils suggèrent une explication alternative, quoique peu probable,: les anticorps reconnaissent principalement la protéine S non clivée. Cependant, les données actuelles suggèrent qu'avec les cellules Vero E6 utilisées dans cette culture, un clivage efficace ne se produit que pendant le conditionnement ou la libération virale ou même lors de la liaison virale ou de l'entrée dans la cellule hôte. Cela nécessite une étude plus approfondie.

Un autre changement qui pourrait être important dans le développement d'un vaccin est la rétention d'un clivage efficace avec la protéine exprimée par pCAGGS, ce qui pourrait signifier que l'expression de la protéine est modulée par l'optimisation du codon du gène S, ou que le virus complet supprime le clivage dans les cellules infectées.

La baisse potentielle des particules virales considérée comme une diminution du rapport des copies du génome aux unités de formation de plaque avec Wash1 pourrait impliquer une infection plus efficace des cellules cibles. La pression de sélection derrière cela reste à découvrir.

Anticorps neutralisants

Les anticorps neutralisants ont été étudiés en utilisant des anticorps dirigés contre l'isolat Munich P3 ne portant pas de délétion avec la séquence de clivage intacte. Ils n'ont trouvé aucune différence entre les deux groupes, les titres d'anticorps montrant une tendance vers le côté supérieur. En d'autres termes, la présence d'une suppression du site de clivage de la furine ne devrait pas affecter la détection de la capacité de neutralisation ou la quantification du titre d'anticorps neutralisants. Néanmoins, d'autres études sont nécessaires pour examiner l'effet de l'utilisation d'autres types de cellules ainsi que les niveaux respectifs de l'enzyme clivée ou non clivée.

Les chercheurs attirent également l'attention sur le fait que le virus utilisé pour infecter les animaux doit être passé le moins de fois possible, et la séquence confirmée, pour tester l'efficacité des vaccins et des antiviraux.

*Avis important

bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies