Une équipe du NDORMS de l’Université d’Oxford a développé une nouvelle approche pour améliorer considérablement la précision du séquençage de l’ARN. Ils identifient la principale source de quantification inexacte dans le séquençage d’ARN à lecture courte et longue, et ont introduit le concept de correction d’erreur de « vote majoritaire », conduisant à une amélioration substantielle du comptage moléculaire de l’ARN.
Crédit d’image : NDORMS, Université d’Oxford
Le séquençage précis du matériel génétique est crucial dans la biologie moderne, notamment pour comprendre et traiter les maladies liées à des anomalies génétiques. Cependant, les méthodologies actuelles se heurtent à des contraintes importantes. Dans une étude historique, un consortium international de chercheurs, dirigé par Adam Cribbs, professeur associé en biologie computationnelle, et Jianfeng Sun, associé de recherche postdoctoral à l’Institut Botnar de l’Université d’Oxford, a développé une méthode innovante pour corriger les erreurs d’amplification PCR : une technique largement utilisée dans le séquençage à haut débit. En identifiant les artefacts de PCR comme la principale source de quantification inexacte, la recherche, publiée dans Nature Methods, relève un défi de longue date consistant à générer des décomptes absolus précis de molécules d’ARN, ce qui est crucial pour diverses applications dans la recherche en génomique.
Les chercheurs se sont concentrés sur les identifiants moléculaires uniques (UMI), qui sont des séquences d’oligonucléotides aléatoires utilisées pour éliminer les biais introduits lors de l’amplification PCR. Bien que les UMI aient été largement adoptées dans les méthodes de séquençage, l’étude révèle que les erreurs de PCR peuvent nuire à l’exactitude de la quantification moléculaire, en particulier sur différentes plates-formes de séquençage.
L’amplification PCR, essentielle pour la plupart des techniques de séquençage d’ARN, peut introduire des erreurs, compromettant l’intégrité des données. Nous avons résolu ce problème en synthétisant des codes-barres UMI à l’aide de blocs de nucléotides homotrimères, améliorant ainsi la correction des erreurs et permettant une quantification quasi absolue des molécules d’ARN, améliorant ainsi considérablement la précision du comptage moléculaire.« .
Jianfeng Sun, associé de recherche postdoctoral, Institut Botnar
Les homotrimères sont des séquences nucléotidiques constituées de trois bases identiques, par exemple AAA, CCC, GGG. En évaluant la similarité des nucléotides des homotrimères, les erreurs sont détectées et corrigées grâce à une méthode de « vote majoritaire ».
L’étude démontre que les UMI homotrimères surpassent considérablement les UMI monomères traditionnelles en réduisant l’enrichissement des plis faussement positifs lors de l’analyse de gènes et de transcrits différentiellement exprimés (DEG et DET). Cette amélioration est vitale pour l’identification et la quantification précises des DEG ou DET, en particulier dans les approches de séquençage en masse. De plus, dans le séquençage unicellulaire, où une amplification PCR étendue est souvent requise, les UMI homotrimères se sont révélés efficaces pour atténuer les effets des artefacts de PCR, améliorant ainsi considérablement la fiabilité des données de séquençage.
«En construisant des UMI à partir de blocs homogènes de nucléosides, nous visions à améliorer la correction des erreurs dans le séquençage à lecture courte et longue, démontrant ainsi notre engagement à améliorer les applications technologiques de séquençage», déclare le professeur agrégé Adam Cribbs, auteur principal de l’article et chef de groupe. en biologie computationnelle.
Cette recherche a de profondes implications. En rectifiant les erreurs de PCR dans les UMI, il améliore considérablement la précision de la quantification moléculaire dans diverses applications de séquençage. Il s’agit d’un outil essentiel pour les chercheurs en séquençage d’ARN en vrac, d’ARN unicellulaire et d’ADN, permettant des analyses précises de l’expression des gènes et des profils moléculaires. La correction améliorée des erreurs UMI réduit non seulement l’incidence des faux positifs, mais offre également de multiples applications de diagnostic, en particulier dans les scénarios nécessitant une analyse longitudinale des échantillons.
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