Des scientifiques de la Northwestern University, aux États-Unis, ont récemment développé une plate-forme de dépistage automatisée à haut débit pour identifier rapidement les anticorps anti-coronavirus 2 (SRAS-CoV-2) du syndrome respiratoire aigu sévère. L’étude est actuellement disponible sur le bioRxiv* serveur de préimpression.
Sommaire
Fond
Les anticorps monoclonaux thérapeutiques développés contre la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 sont devenus une intervention prometteuse pour traiter les patients gravement malades du coronavirus 2019 (COVID-19). De même, les anticorps générés en réponse aux vaccins COVID-19 ont montré une grande efficacité dans la prévention de l’infection par le SRAS-CoV-2 et des maladies symptomatiques. Outre l’usage thérapeutique, les anticorps sont largement utilisés dans les dosages immunologiques pour la détection rapide d’antigènes viraux.
Les plates-formes de criblage actuellement utilisées pour l’identification d’anticorps spécifiques d’un antigène utilisent l’évolution dirigée ou l’isolement de clones de cellules B uniques à partir d’individus récupérés par COVID-19 ou d’animaux infectés. L’isolement, l’évaluation et l’identification du meilleur candidat anticorps nécessitent une série d’expériences fastidieuses et laborieuses, notamment le clonage, la transfection, l’expression des protéines à base de cellules, la purification des protéines et l’évaluation de la liaison. Le délai d’exécution de ces procédures est de quelques semaines à plusieurs mois. De plus, ces procédures présentent souvent une faible efficacité pour identifier de puissants anticorps neutralisants contre le SRAS-CoV-2.
Dans la présente étude, les scientifiques ont développé une plate-forme automatisée de découverte d’anticorps qui combine la synthèse de protéines sans cellules avec un criblage d’interaction protéine-protéine à haut débit.
Plateforme de découverte d’anticorps à haut débit
La plate-forme combine quatre étapes principales, y compris l’assemblage et l’amplification d’ADN acellulaire, la synthèse de protéines acellulaires, un dosage immunosorbant à liaison homogène de proximité luminescent amplifié et un flux de travail automatisé utilisant la manipulation robotique et acoustique des liquides. Les systèmes de synthèse de protéines acellulaires utilisés dans l’étude peuvent générer des anticorps directement à partir de modèles d’ADN linéaires. De même, le dosage immunologique peut caractériser rapidement l’interaction protéine-protéine sans nécessiter de purification des protéines.
La plate-forme ne prend que 24 heures pour cribler et caractériser des centaines d’anticorps de liaison spécifiques à l’antigène. Pour la validation fonctionnelle, les scientifiques ont utilisé cette plate-forme de dépistage automatisée pour tester un panel de 120 anticorps précédemment identifiés ciblant la protéine de pointe du SRAS-CoV-2.
Un flux de travail de dépistage d’anticorps sans cellule à haut débit. a, Schéma des étapes impliquées dans le flux de travail de dépistage des anticorps acellulaires. b, Schéma de l’écran AlphaLISA pour neutraliser les anticorps par compétition avec ACE2 pour le SARS-CoV-2 RBD. c, Évaluation des anticorps neutralisants commerciaux (nAbs) dans le criblage de compétition AlphaLISA ACE2 (n = 3 répétitions indépendantes ± SEM). d, Comparaison des puissances signalées et mesurées des anticorps neutralisants commerciaux.
Détection de l’interaction protéine-protéine à l’aide d’une plateforme de découverte d’anticorps à haut débit
La capacité de liaison des candidats anticorps générés à l’aide des systèmes acellulaires a été évaluée à l’aide du dosage immunosorbant lié homogène de proximité luminescent amplifié. Cette méthode de criblage à haut débit peut caractériser les interactions protéine-protéine directement à partir de réactions de synthèse de protéines acellulaires. De plus, la méthode immobilise de manière non covalente les protéines d’intérêt sur les billes donneuses et acceptrices, qui produisent un signal chimioluminescent lors des interactions. Surtout, la technique peut caractériser la liaison directe anticorps-antigène ainsi que la liaison compétitive pour des épitopes spécifiques.
L’analyse de cinq anticorps disponibles dans le commerce a révélé que cet immunoessai pourrait déterminer la capacité des anticorps à entrer en compétition avec l’enzyme humaine de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2) pour se lier au domaine de liaison au récepteur de pointe (RBD) du SRAS-CoV-2. Des tests supplémentaires avec des chaînes lourdes et légères du fragment de liaison à l’antigène ont révélé que le test est très cohérent dans la prédiction de l’assemblage d’anticorps.
L’efficacité du dosage immunologique pour caractériser la liaison des anticorps a été évaluée en outre à l’aide de panels distincts d’anticorps connus pour se lier au trimère de pointe ou à la pointe RBD ou entrer en compétition avec l’ACE2 pour la liaison à la RBD. Ces expériences comprenaient un panel de 120 anticorps déjà identifiés et testés.
Les résultats ont révélé que le dosage immunosorbant lié de manière homogène à proximité luminescente amplifiée est très efficace pour détecter spécifiquement les anticorps qui se lient au trimère de pointe, à la pointe RBD ou entrent en compétition avec l’ACE2 pour la liaison à la RBD.
Étant donné que plus de 90 % des anticorps neutralisants agissent en bloquant l’interaction ACE2 – RBD, l’étude a comparé la compétition ACE2 contre la neutralisation du virus. Les résultats ont révélé que le test pouvait systématiquement identifier des anticorps neutralisants puissants grâce au mécanisme de blocage de l’ACE2. Cependant, le test a montré une faible efficacité dans la caractérisation des anticorps neutralisants moins puissants.
Performances du flux de travail de dépistage des anticorps sans cellules évaluées sur les anticorps neutralisants du SRAS-CoV-2. af, les données AlphaLISA sont présentées comme la moyenne de 3 réplicats indépendants. Une ligne pointillée indique trois écarts types du signal de fond. ab, Heatmap de la liaison d’anticorps précédemment publiés mesurée à l’aide d’AlphaLISA pour détecter la liaison au trimère S (échelle log10), la liaison RBD (échelle log10) et la compétition ACE2 (échelle linéaire). Les données AlphaLISA sont présentées comme la moyenne de 3 réplicats indépendants. La valeur IC50 de neutralisation la plus faible signalée est également tracée à des fins de comparaison (échelle log10) et un X indique qu’aucune donnée pertinente n’est disponible (tableau supplémentaire 2). une Heatmap de la liaison de 36 anticorps divers. b, Heatmap de la liaison de tous les 84 anticorps dans le Brouwer et al. base de données. cd, Parity plots comparant l’AlphaLISA aux 84 anticorps dans le Brouwer et al. ensemble de données par rapport aux données ELISA publiées. Une ligne pointillée indique trois écarts types par rapport à l’arrière-plan. c, S trimer reliure. d, liaison RBD. e, Comparaison des données de liaison S trimer et RBD AlphaLISA. f, Graphique de parité comparant les données de compétition AlphaLISA ACE2 pour les 84 anticorps dans le Brouwer et al. ensemble de données par rapport aux données publiées de neutralisation des pseudovirus. Les anticorps qui ont été rapportés en compétition avec l’ACE2 par Brouwer et al. sont tracés en rouge.
Importance de l’étude
L’étude décrit le développement et la validation d’une plate-forme de découverte d’anticorps automatisée à haut débit qui utilise des systèmes d’expression et de criblage acellulaires. Le principal avantage de la plate-forme est la rapidité d’exécution et le débit. Par exemple, un seul chercheur peut caractériser un panel de 120 anticorps en 24 heures en utilisant cette méthode.
Un autre avantage important est le profilage direct des anticorps synthétisés à l’aide d’extraits acellulaires. Cela supprime le besoin de procédures de purification des protéines qui sont souvent considérées comme l’étape limitante dans le dépistage des anticorps.
Comme l’ont mentionné les scientifiques, cette plate-forme à haut débit peut être utilisée pour une identification rapide et facile d’anticorps puissants pour des applications thérapeutiques, diagnostiques et autres applications de recherche fondamentale.
