Le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) est apparu pour la première fois en décembre 2019 à Wuhan, en Chine, et s'est rapidement propagé à d'autres pays, provoquant une pandémie mondiale sans précédent.
Aujourd'hui, le virus s'est propagé dans 207 pays, avec 35,65 millions de cas confirmés dans le monde et plus de 1,04 million de décès. Bien qu'il soit connu d'après l'expérience antérieure avec le SRAS-CoV-1 et le syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS) que les coronavirus sont très virulents, il n'existe toujours aucun vaccin ou médicament approuvé par la FDA pour aucun coronavirus.
Étant donné que le SRAS-CoV-2 est étroitement lié aux coronavirus SRAS-CoV-1 et MERS, il est classé comme agents de sélection du groupe de risque 3, ce qui signifie que l'utilisation des virus vivants est limitée aux installations de niveau de biosécurité 3 (BSL-3). Cela rend la recherche sur le SRAS-CoV-2 inaccessible à la plupart des laboratoires de recherche fonctionnels aux États-Unis, inhibant un effort scientifique collectif qu'une telle pandémie appelle.
Création de modèles BSL-2 pour faciliter la recherche virale
Le développement de modèles et de tests viraux compatibles BSL-2 est impératif pour faciliter l'étude du bourgeonnement et de l'entrée virale et des approches thérapeutiques potentielles. Dans le passé, des modèles BSL-2 d'autres agents pathogènes BSL-3 et -4 hautement virulents, y compris le SRAS-CoV-1, le MERS, le virus Ebola et le virus de Lassa, ont été développés sous la forme de particules de type virus (VLP). .
Le SRAS-CoV-2, comme d'autres coronavirus, utilise l'enzyme de conversion de l'angiotensine 2 (ACE2), le récepteur de surface des cellules humaines, pour permettre l'absorption cellulaire des particules virales. Les 4 protéines structurales du virus – pic (S), membrane (M), nucléocapside (N) et enveloppe (E) – seraient responsables du maintien de l'intégrité structurale du virion SARS-CoV-2.
Dans un récent article de pré-impression publié sur le bioRxiv* serveur, des chercheurs du Purdue Institute of Inflammation, Immunology, and Infectious Disease, Purdue University, West Lafayette, IN, discutent de leurs efforts pour évaluer les 4 protéines structurelles du SRAS-CoV-2 pour leur capacité à produire des VLP à partir de cellules humaines pour créer un système compétent pour les études BSL-2 du SRAS-CoV-2. L'étude visait à développer des VLP qui sont morphologiquement et fonctionnellement pertinentes qui aident à étudier le bourgeonnement et l'entrée du SRAS-CoV-2.
Dans leurs travaux, l'équipe de chercheurs fournit des méthodes et des ressources pour la production, la purification et le marquage fluorescent et APEX2 des VLP du SRAS-CoV-2, qui peuvent tous aider à évaluer les mécanismes de bourgeonnement et d'entrée viraux et l'analyse des inhibiteurs de médicaments sous BSL. -2 conditions.
Microscopie électronique à balayage des cellules transfectées par des protéines structurales virales. Les cellules HEK293 ont été ensemencées sur des lamelles et transfectées individuellement ou en combinaison avec M, N, E et / ou S. Les cellules ont été fixées avec du glutaraldéhyde 72 heures après la transfection et maintenues à 4 ° C jusqu'à ce qu'elles soient fixées avec du tétroxyde d'osmium. Les échantillons ont ensuite été progressivement déshydratés avec de l'éthanol et complètement déshydratés avec un sécheur à point critique. Une fois déshydratés, les échantillons ont été montés sur des broches en aluminium avec un ruban de carbone double face, chargés de peinture argentée et enduits par pulvérisation avant l'imagerie. Le grossissement des images varie de 10 000x à 80 000x.
Un modèle réaliste d'entrée virale du SRAS-CoV-2 disponible dans le cadre de la BSL-2
Alors que la pandémie de SRAS-CoV-2 continue de faire rage, il est vital que davantage de travail soit fait pour améliorer notre compréhension fondamentale des mécanismes moléculaires du virus. Dans cette étude, l'équipe a analysé la capacité des protéines structurales du SRAS-CoV-2 à former des VLP et a constaté que la protéine M seule n'était pas suffisante pour la formation de VLP, mais la co-expression de M avec des protéines N ou S était essentielle pour former des VLP. . Ils ont également découvert que la protéine E a un effet additif dans l'incorporation de N dans les VLP ainsi que dans la production de VLP, ce qui met en évidence le rôle clé que joue E dans l'assemblage et la libération du virus.
Selon les auteurs, leurs résultats présentent un nouveau modèle d'entrée virale SARS-CoV-2 dans un contexte BSL-2: SARS-CoV-2 GFP- et APEX2-VLP. Selon les données de virus vivants, les GFP-VLP se colocalisent avec Rab5, le marqueur de l'endosome précoce, et LAMP1, le marqueur de l'endosome tardif.
«Dans ce travail, nous présentons également pour la première fois un modèle réaliste d'entrée virale SARS-CoV-2 disponible dans un contexte BSL-2: SARS-CoV-2 GFP- et APEX2-VLP. Conformément aux données virales vivantes, les GFP-VLP se colocalisent avec le marqueur endosomique précoce, Rab5, et le marqueur endosomique tardif, LAMP1. »
L'équipe prévoit de concentrer ses travaux futurs sur la miniaturisation de son test d'entrée GFP-VLP et son utilisation dans le criblage des inhibiteurs de l'absorption virale et de l'entrée. Outre l'utilisation de la microscopie confocale pour évaluer les événements d'entrée de GFP-VLP, ils ont également utilisé la technologie de marquage APEX pour rendre possible l'utilisation de la microscopie électronique pour l'évaluation de l'entrée du SARS-CoV-2.
Les approches traditionnelles pour démontrer les structures de type VLP à l'aide de TEM basent leur identification uniquement sur la morphologie. En utilisant le marquage APEX, l'équipe a pu montrer la localisation de la protéine S pendant l'assemblage et le bourgeonnement des VLP, ainsi que la formation et l'exportation d'APEX-VLP à partir de la lumière ERGIC.
«Au total, cette recherche fournit de nombreuses ressources aux autres laboratoires BSL-2 intéressés à rejoindre le domaine en croissance pour essayer de comprendre l'assemblage, le bourgeonnement et la dynamique d'entrée du SRAS-CoV-2, les questions biochimiques et biophysiques sur les quatre protéines structurales et le médicament dépistage des inhibiteurs de l'assemblage viral, du bourgeonnement ou de l'entrée. »
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé ou être traités comme des informations établies.
