Même si COVID-19 continue de se répandre dans le monde, les chercheurs se concentrent sur le développement de vaccins et d'antiviraux. La majeure partie de cette étude vise la protéine de pointe (S) du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2 (SRAS-CoV-2), une composante trimérique de la particule virale qui est responsable de l'attachement au récepteur de l'hôte, la conversion de l'angiotensine enzyme 2 (ACE2). Maintenant, une nouvelle étude par des chercheurs de Janssen Vaccines & Prevention BV et de l'Université de Leiden et publiée sur le serveur de préimpression bioRxiv* utilise cryoEM pour révéler la structure de ce trimère, afin de soutenir à la fois le développement de vaccins et les tests de diagnostic basés sur la production d'anticorps.
Sommaire
La protéine Spike
La protéine S est une grande glycoprotéine composée de deux sous-unités, médiant à la fois la liaison au récepteur des cellules hôtes et la fusion membranaire du virus et de la cellule hôte pour permettre l'entrée virale et l'infection de la cellule hôte. La sous-unité S1 a deux parties distinctes, un domaine N-terminal (NTD) et un domaine de liaison au récepteur (RBD).
Illustration 3D du diagramme de structure du SRAS-CoV-2. Crédit d'image: Orpheus FX / Shutterstock O By
À l'interface S1 / S2, il existe une protéase de type furine qui est requise pour le clivage de la protéine, qui peut également être effectuée par l'action de TMPRSS2, un site hautement conservé juste avant le peptide de fusion S2. La protéine S pré-fusion a son RBD alternativement dans les configurations haut et bas ou ouvert et fermé.
Dans le premier cas, le site de liaison du récepteur est temporairement exposé au récepteur de la cellule hôte ou à tout anticorps. En raison de ce changement de conformations qui caractérise intrinsèquement la protéine, la protéine S est, comme les autres protéines de fusion de classe I, une protéine naturellement métastable.
Caractérisation structurale de S-fermé. (A) Structure Cryo-EM de la classe de trimères la plus abondante de S-fermé-Fd – un trimère de protéine S fermé. Les monomères sont colorés en orange clair, blanc et gris et la pointe est représentée de côté (panneau supérieur) et de dessus (panneau inférieur). (B) Chacune des quatre mutations ponctuelles introduites dans S-fermé-Fd montré en détail. Les domaines de la nouvelle structure sont colorés selon le même code couleur que celui utilisé sur la figure S1. La limite entre les monomères a également été indiquée par une ligne pointillée orange, le cas échéant. Deux rotamères possibles de K986 sont indiqués car l'un ou l'autre n'a pas pu être définitivement attribué en fonction de la densité.
Cibler la protéine Prefusion S
La forme de préfusion de la protéine S contient les épitopes auxquels les anticorps neutralisants se lient et est donc une cible privilégiée pour le développement d'un immunogène. Pour que cela se produise, il est nécessaire de stabiliser la protéine de préfusion, car ainsi plus de glycoprotéines recombinantes sur les particules virales sont exprimées, stimulant une réponse immunitaire.
Une façon de stabiliser cette protéine est de stabiliser la boucle de charnière qui se trouve juste avant l'hélice centrale. Dans les précédents SARS-CoV et MERS-CoV, cela a été accompli en mutant deux acides aminés successifs en proline dans la sous-unité S2 dans la région située entre l'hélice centrale et la répétition d'heptade (HR) 1.
Cela a également été transféré dans la protéine SARS-CoV-2 S (SARS-CoV-2 S-2P). En revanche, cette protéine S mutée est instable. La présente étude décrit les moyens d'améliorer sa stabilité.
Un autre aspect à considérer est que les anticorps neutralisants ont la puissance la plus élevée lorsqu'ils se lient aux épitopes RBD à l'état fermé ou en aval. Cela signifie que la protéine de préfusion doit être stabilisée dans cette conformation pour obtenir un immunogène plus fort.
Stabiliser la protéine S en conformation fermée
L'instabilité de la protéine S ne s'améliore donc pas entièrement même avec l'introduction de la double proline dans la boucle de charnière. L'étude actuelle, basée sur une conception basée sur la structure, a identifié de nouvelles mutations stabilisantes dans les domaines S1 et S2.
Les chercheurs démontrent qu'avec une expression accrue du trimère par les mutations individuelles de la proline, le variant K986P diminue l'interaction avec la tête S1. Cela fait que le RBD se trouve dans le nord de l'état, comme évalué par une liaison accrue avec à la fois l'ACE2 et l'anticorps CR3022. Lorsque la deuxième mutation stabilisante, à savoir V987P, est en place, cet effet est partiellement compensé.
Les chercheurs montrent les effets de deux groupes de substitutions supplémentaires. Le premier est dans la région S2 heptad repeat (HR) 1, qui est radicalement affectée par la fusion. Dans le second, la proline et la glycine participent à plusieurs mutations en boucle pour stabiliser le trimère, augmentant le rendement. Ces mutations S2 aident probablement au repliement des protéines requis pour le changement de conformation qui déclenche la fusion. Ainsi, l'expression de la protéine S de préfusion augmente.
Ils ont ensuite retrouvé quatre mutations à point unique (D614N, A892P, A942P et V987P) qui font que la protéine S reste dans une conformation stable fermée, mais avec une expression 6,4 fois plus élevée, une stabilité à la chaleur et des cycles de gel-dégel et des propriétés antigéniques similaires à celles d'un trimère fermé.
Combiner les mutations pour une efficacité optimale
Lorsque plusieurs de ces mutations ont été combinées, les chercheurs ont obtenu un trimère fermé S très stable avec une expression de glycoprotéine plus élevée. Ils comprenaient à la fois D614N et A892P, qui stabilisaient tous deux la protéine S, et A942P, ce qui augmentait le rendement de la protéine.
La combinaison de ceux-ci avec les prolines dans la boucle de charnière a donné un mutant quadruple (D614N + A892P + A942P + V987P), et un mutant quintuple (tous ces éléments plus K986P). Les deux ont produit une multiplication par cinq des rendements, par rapport à la variante S-2P, mais cette dernière avait augmenté la liaison ACE2. Lorsque le domaine de trimérisation hétérologue a été supprimé, la protéine est restée stable et, en fait, le rendement en protéines a augmenté de 6,4 fois par rapport au variant S-2P, même si les conceptions de protéines S solubles trouvent que ce domaine de repli est essentiel.
Pourquoi cibler la protéine de pointe fermée?
L'importance de cibler la protéine de pointe avec la conformation RBD fermée est que c'est ainsi que le virus est pendant le processus de transmission. Ainsi, les anticorps qui ciblent le virus dans cet état sont susceptibles d'être plus protecteurs contre l'infection. Deuxièmement, dans cet état, la surface est plus conservée, et donc plus d'anticorps à réactivité croisée peuvent être induits.
Les chercheurs résument: «Un trimère S fermé et stable avec un minimum de mutations non exposées et sans repli qui montre une augmentation significative des niveaux d'expression peut faire avancer le développement de nouveaux immunogènes vaccinaux (sous-unités) et améliorer encore les vaccins génétiques, les diagnostics ou l'isolement de des anticorps. «
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
