Dans une étude récente publiée dans le Micro-organismes journal, des chercheurs chinois ont examiné les utilisations des techniques d’édition du génome basées sur les chromosomes artificiels bactériens (BAC) dans la recherche sur l’herpèsvirus.
Revue : Méthodes d’édition du génome bactériennes artificielles basées sur les chromosomes et applications dans la recherche sur l’herpèsvirus. Crédit d’image : Panuwach/Shutterstock
Les virus de l’herpès sont des agents pathogènes humains et animaux importants. Explorer le rôle de gènes spécifiques, comprendre la pathogenèse des virus de l’herpès et générer de nouveaux vaccins et thérapies antiviraux nécessitent tous la manipulation du vaste génome. La technique du BAC a considérablement amélioré la puissance des études sur les herpèsvirus pour éditer les génomes des virus. Ces dernières années, des progrès ont été réalisés dans la manipulation du génome à base de BAC et les procédures de dépistage des BAC recombinants, ce qui a facilité la recherche sur le virus de l’herpès.
Sommaire
Méthodes d’édition du génome de l’herpèsvirus basées sur le BAC
Méthode de recombinaison RecA
La recombinaison RecA est un système de recombinaison homologue endogène bactérien constitué de recombinase RecA et de protéines accessoires associées. RecB possède également une activité exonucléase, facilitant la formation d’acide désoxyribonucléique simple brin à 30 extrémités (ssDNA). RecA se lie aux sites ssDNA créés par les exonucléases et initie le processus de reconnaissance des zones homologues sur le BAC pour un recuit et une interaction futurs. Lorsqu’une interaction réussie se forme, les filaments de nucléoprotéines capturent l’ADN double brin (ADNdb) et échangent des brins pour générer de l’ADN hétéroduplex.
Bien que l’approche de recombinaison homologue médiée par RecA pour l’édition des génomes d’herpèsvirus présents dans les cellules eucaryotes soit plus efficace que les méthodes conventionnelles, elle présente des limites considérables. En raison de l’existence de séquences répétitives dans les génomes du virus de l’herpès, un problème clé est que l’expression de RecA peut générer une instabilité dans le clone BAC du virus de l’herpès, ce qui peut entraîner des mutations du génome viral.
Procédure de recombinaison λ-rouge
Le système de recombinaison λ-red comprend les protéines Exo, Beta et Gam et est généré à partir du phage. La protéine Gam peut empêcher la liaison de Rec BCD aux extrémités de l’ADNdb, inhibant l’exonucléase RecBCD et limitant la dégradation de l’ADNdb exogène. Les protéines exo peuvent interagir avec les terminaisons des donneurs d’ADNdb avec des séquences homologues flanquant le gène cible. De plus, la protéine bêta est essentielle pour le processus de recombinaison homologue λ-red. Étant une protéine qui se lie à l’ADN simple brin, la protéine bêta interagit avec l’ADNsb généré par la protéine Exo. La protéine bêta facilite l’annelage du fragment d’ADN du donneur et la séquence homologue observée sur le site cible de la réplication du virus de l’herpès BAC. La recombinaison homologue se termine par la réplication de l’ADN.
Méthode d’édition de base
La répétition palindromique courte régulièrement espacée (CRISPR)/Cas 9 est une puissante technologie d’édition du génome qui a été appliquée efficacement à une grande variété d’organismes eucaryotes, y compris les cellules souches embryonnaires, les lignées cellulaires humaines, les souris, la drosophile et l’Arabidopsis. En utilisant la technologie d’édition de gènes CRISPR/Cas 9 avec une technologie d’édition de base précise, les scientifiques ont récemment développé une méthode d’édition de gènes efficace impliquant un seul acide ribonucléique guide (sgRNA) et un complexe contenant des protéines Cas9 modifiées, un inhibiteur de l’uracile glycosylase (UGI) et cytosine désaminases.
Contrairement aux protéines Cas9 de type sauvage, la Cas9 modifiée est dépourvue d’activité d’endonucléase et est catalytiquement inactive. La cytosine désaminase transforme un site particulier de la cytosine (C) en uracile (U). À ce stade, les inhibiteurs de l’uracile glycosylase peuvent bloquer l’excision du produit intermédiaire U, augmentant l’efficacité de la conversion de C en T sur la chaîne d’ADN et permettant une édition précise à base unique de G en A et de C en T.
Schéma de principe de la méthode d’édition de base : (un) dCas9 médie le ciblage sans formation de DSB ; (b) la cytosine désaminase convertit C en U; (c) l’édition précise à base unique est complète avec la réplication de l’ADN.
Techniques de dépistage des mutants de l’herpèsvirus
Cassette à sélection unique
Dans la technique de la cassette de sélection unique, avec des bras homologues présents des deux côtés du site cible ainsi que la séquence à insérer, le donneur ajoute généralement des cassettes de sélection, comme des gènes de résistance, afin de sélectionner les clones BAC conçus. Le criblage effectué avec le phénotype du gène marqueur pertinent réduit significativement le bruit de fond des cellules qui n’ont pas subi de recombinaison, ce qui se traduit par une efficacité de criblage supérieure à 95 %. Cependant, l’insertion d’un gène marqueur dans un gène cible peut altérer la fonction des gènes à la fois en aval et en amont de l’emplacement de ciblage.
Association d’une cassette de sélection à un motif de reconnaissance de recombinase site-spécifique
Pour l’édition des génomes de l’herpèsvirus, des systèmes de recombinase spécifiques au site, y compris le système cible de reconnaissance de la flippase (Flp)-flippase dérivée de la levure (FRT) et le Cre-locus dérivé du phage P1 du système X-over P1 (loxP) sont souvent utilisés. Pendant le processus d’édition, le donneur doit incorporer des régions LoxP/FRT codirectionnelles des deux côtés de la cassette de sélection. L’expression de l’enzyme recombinase élimine la cassette de sélection positionnée entre les deux sites. Bien que cette stratégie élimine efficacement la longue cassette de sélection avec un taux de réussite presque parfait, elle laisse un seul site LoxP ou FRT à l’emplacement intergénique de l’insertion et de l’excision du BAC.
Conclusion
Les résultats de l’étude ont montré que l’utilisation de la technologie de recombinaison BAC a remarquablement élargi l’avenir de l’étude de l’herpèsvirus. Cependant, l’efficacité de l’édition de gènes basée sur le BAC doit encore être développée. Les chercheurs pensent que le développement de technologies d’édition du génome viral plus efficaces basées sur le BAC améliorerait la précision et l’efficacité de l’édition du génome tout en réduisant le temps de test et les ressources nécessaires.
