Même si la pandémie de COVID-19 progresse à travers le monde, le manque de tests de diagnostic cohérents a été un bug, empêchant le contrôle de la santé publique de la propagation de l'infection. Une nouvelle étude par des chercheurs de l'Université de l'Illinois Urbana-Champaign et publiée sur le serveur de préimpression bioRxiv* en juin 2020 signale une nouvelle méthode de test qui utilise la salive, ne nécessite pas d'extraction d'ARN et peut être étendue rapidement et à peu de frais.
Les chercheurs décrivent ainsi leurs conclusions: «Ce processus à base de salive est simple sur le plan opérationnel, utilise des matériaux facilement disponibles et peut être facilement mis en œuvre par les sites de test existants, permettant ainsi des tests à haut débit, rapides et répétés de grandes populations.
Nouveau coronavirus SARS-CoV-2 Micrographie électronique à transmission d'une particule de virus SARS-CoV-2, isolée d'un patient. Image capturée et rehaussée de couleurs au NIAID Integrated Research Facility (IRF) à Fort Detrick, Maryland. Crédits: NIAID
Sommaire
Besoin de tests simples, évolutifs et rapides
L'étude était motivée par la nécessité de «tests moléculaires pratiques, reproductibles et à grande échelle pour le SRAS-CoV-2», qui «seraient une arme clé pour aider à contrôler la pandémie de COVID-19». À l'heure actuelle, des écouvillons nasopharyngés (NP), nasaux et oropharyngés sont utilisés pour les tests de PCR de routine. Ceux-ci sont non seulement invasifs mais nécessitent de nombreux éléments d'équipement qui ne sont pas facilement disponibles, ce qui rend les tests répétés difficiles. Ceux-ci incluent le besoin d'écouvillons, d'équipements de protection individuelle (EPI), de supports de transport viraux (VTM) et de kits pour l'isolement et la purification de l'ARN.
Deuxièmement, le risque posé par de tels tests est important car le virus se propage principalement par les aérosols et les gouttelettes respiratoires. Cependant, la salive est une excellente source alternative d'échantillon. La présente étude vise à comprendre les avantages de l'utilisation de la salive pour les tests SARS-CoV-2.
La nécessité d'une telle étude réside dans la possibilité qu'elle offre d'une plate-forme rentable et à haut débit pour tester des milliers d'individus, le cas échéant, en une seule journée. Cela pourrait permettre des tests répétés d'individus pour identifier des groupes de personnes qui peuvent interagir en toute sécurité pour poursuivre les opérations commerciales, par exemple, sous réserve de leur isolement des autres transporteurs ou patients possibles.
L'étude actuelle: PCR directe à partir de la salive
Plusieurs rapports antérieurs ont montré que la détection directe du virus à partir d'écouvillons ou de VTM sans étapes d'extraction d'ARN. La présente étude examine le potentiel de détection directe de la salive, pour mettre en place un flux de travail simple, rapide et peu coûteux pouvant être utilisé pour n'importe quel laboratoire de test par RT-PCR.
Les chercheurs ont comparé les écouvillons NP aux échantillons de salive, car la salive est facile à collecter, est connue pour contenir le virus, est une source potentielle de transmission virale et peut être utilisée pour développer un flux de travail qui peut tester jusqu'à 10000 personnes par jour. Peu d'informations sont disponibles sur la manière dont la charge virale évolue dans le temps dans la salive, mais ce que l'on sait suggère qu'elle est la plus élevée au cours de la première semaine d'infection, c'est-à-dire pendant la période d'incubation.
En revanche, la salive ne contient plus de virus vivant susceptible d'être cultivé au bout de 10 jours à compter du premier symptôme, contrairement aux tampons NP, qui sont toujours positifs au stade convalescent. Cependant, le patient n'est alors pas infectieux.
Inactivation, tamponnage et additifs
Les chercheurs ont utilisé respectivement deux versions du virus inactivé par irradiation gamma et chauffage. Ils ont découvert qu'après avoir chauffé à 95 ° C pendant 30 minutes, ils avaient atteint une identification à 100% de tous les SARS-CoV-2 dans tous les échantillons. Un court temps de chauffage de 5 minutes n'offre pas la même sensibilité car les inhibiteurs salivaires de la RT-PCR ne sont pas inactivés.
En bref, selon l'étude, «un chauffage adéquat des échantillons de patients permet la détection de virus sans avoir besoin d'extraire l'ARN, avec l'avantage supplémentaire d'inactiver les échantillons, réduisant ainsi considérablement les risques biologiques».
Ils ont également constaté que l'utilisation du tampon TBE avec les échantillons de salive conduisait à des taux de détection exceptionnels pour l'ARN sans extraction d'ARN. Parfois, un détergent est ajouté pour améliorer la viscosité de la salive et améliorer les taux de détection. Lorsque l'étude actuelle a évalué les effets de l'ajout de TBE ou du détergent Tween 20 ou des deux avant ou après le chauffage, ils ont conclu: «le protocole le plus sûr et le plus rationalisé serait: collecte d'échantillons de salive, chaleur à 95oC pendant 30 min, ajouter le tampon TBE et Tween 20, puis RT-qPCR. «
Le virus est libéré dans la salive sur une large plage de 10 000 à 10 milliards d'exemplaires par ml. La limite de détection actuelle (LOD) a été déterminée à environ 1 000 copies / ml après extraction de l'ARN, et dans la salive, à environ 5 600 copies / ml. Avec le procédé actuel, la LOD a été déterminée à environ 500 copies / ml pour un virus irradié et à environ 5 000 copies / ml pour un virus inactivé par la chaleur. Des résultats équivalents ont été obtenus avec plusieurs outils analytiques.
Les chercheurs ont ensuite examiné la pertinence de l'échantillon pour le stockage. Ils ont constaté que la salive peut être stockée sous une forme stable dans différentes conditions de stockage, peut être chauffée dans des récipients de volume variable mais que la centrifugation affecte négativement les résultats directs de la RT-PCR.
L'évaluation clinique initiale montre d'excellents résultats
À l'aide d'échantillons cliniques, ils ont constaté qu'avec des tests d'échantillons en double, la détection directe du virus salivaire par RT-PCR avait une sensibilité, une spécificité, une valeur prédictive positive et une valeur prédictive négative de 100%. Pourtant, les faux négatifs et les faux positifs étaient de 0. Ces évaluations préliminaires se sont révélées très prometteuses et devraient inciter à d'autres comparaisons directes de cette méthode avec la détection de l'écouvillon NP, en utilisant le flux de travail optimisé.
Les avantages de cette méthode sont nombreux. Non seulement c'est simple, mais cela économise du temps et des efforts pour obtenir des échantillons cliniques. En ne procédant pas à l'extraction et à la purification de l'ARN, l'utilisation de réactifs et d'autres équipements de laboratoire est réduite, ce qui entraîne une économie d'environ 10 $ par test, et plus si des échantillons groupés sont utilisés. Sa compatibilité avec de nombreuses plates-formes réduit les risques de goulots d'étranglement d'approvisionnement.
Les chercheurs résument: «Décrite ici est une méthode de diagnostic sensible pour le SRAS-CoV-2 qui est simple sur le plan opérationnel, contourne les goulots d'étranglement de la chaîne d'approvisionnement, évalue un fluide infectieux cliniquement pertinent, convient aux tests répétés à grande échelle, est rentable et peut être facilement adopté par d'autres laboratoires. Les tests à grande échelle du SRAS-CoV-2 seront une arme puissante pour empêcher la propagation de ce virus et aider à contrôler la pandémie de COVID-19. »
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
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