Une équipe de scientifiques, dont des chercheurs du National Synchrotron Light Source II (NSLS-II) – une installation du Bureau des sciences du Département de l'énergie (DOE) des États-Unis au Brookhaven National Laboratory du DOE – a démontré une nouvelle technique d'imagerie des protéines dans 3 -D avec une résolution à l'échelle nanométrique. Leur travail, publié dans le Journal de l'American Chemical Society, permet aux chercheurs d'identifier la localisation précise des protéines dans les cellules individuelles, atteignant la résolution de la membrane cellulaire et les plus petites organites subcellulaires.
Dans le monde de la biologie structurale, les scientifiques utilisent des techniques telles que la cristallographie aux rayons X et la microscopie cryoélectronique pour en savoir plus sur la structure précise des protéines et en déduire leurs fonctions, mais nous ne savons pas où elles fonctionnent dans une cellule. Si vous étudiez une maladie particulière, vous devez savoir si une protéine fonctionne au mauvais endroit ou pas du tout. «
Lisa Miller, auteure correspondante et scientifique NSLS-II
La nouvelle technique développée par Miller et ses collègues est similaire dans son style aux méthodes traditionnelles de microscopie à fluorescence en biologie, dans lesquelles une molécule appelée protéine fluorescente verte (GFP) peut être attachée à d'autres protéines pour révéler leur emplacement. Lorsque la GFP est exposée aux UV ou à la lumière visible, elle émet une fluorescence vert vif, illuminant une protéine autrement «invisible» dans la cellule.
« En utilisant la GFP, nous pouvons voir si une protéine se trouve dans des structures subcellulaires de plusieurs centaines de nanomètres, comme le noyau ou le cytoplasme », a déclaré Miller, « mais des structures comme une membrane cellulaire, qui n'est que de 7 à 10 nanomètres. , sont difficiles à voir avec des étiquettes de lumière visible comme la GFP. Pour voir des structures de la taille de 10 nanomètres dans une cellule, vous bénéficiez grandement de l'utilisation des rayons X. «
Pour surmonter ce défi, les chercheurs du NSLS-II ont fait équipe avec des scientifiques du Massachusetts Institute of Technology (MIT) et de l'Université de Boston (BU) qui ont développé une étiquette sensible aux rayons X appelée étiquette de liaison aux lanthanides (LBT). Les LBT sont de très petites protéines qui peuvent se lier étroitement aux éléments de la série des lanthanides, tels que l'erbium et l'europium.
« Contrairement à la GFP, qui émet une fluorescence lorsqu'elle est exposée aux UV ou à la lumière visible, les lanthanides sont fluorescents en présence de rayons X », a déclaré l'auteur principal Tiffany Victor, chercheur associé au NSLS-II. « Et puisque les lanthanides ne se produisent pas naturellement dans la cellule, lorsque nous les voyons au microscope à rayons X, nous connaissons l'emplacement de notre protéine d'intérêt. »
Les chercheurs de NSLS-II, MIT et BU ont travaillé ensemble pour combiner la technologie LBT avec la fluorescence X.
« Bien que les LBT aient été largement utilisés au cours de la dernière décennie, ils n'ont jamais été utilisés pour des études de fluorescence X », a déclaré Miller.
Au-delà de l'obtention d'images de plus haute résolution, la fluorescence X fournit simultanément des images chimiques sur tous les oligo-éléments d'une cellule, tels que le calcium, le potassium, le fer, le cuivre et le zinc. Dans d'autres études, l'équipe de Miller étudie comment les oligo-éléments comme le cuivre sont liés à la mort des neurones dans des maladies comme la maladie d'Alzheimer. La visualisation de l'emplacement de ces éléments par rapport à des protéines spécifiques sera la clé de nouvelles découvertes.
En plus de leur compatibilité avec les rayons X, les LBT sont également bénéfiques pour leur taille relativement petite, par rapport aux étiquettes de lumière visible.
« Imaginez que vous aviez une queue attachée à vous qui était de la taille de tout votre corps, ou plus », a déclaré Miller. « Il y aurait beaucoup d'activités normales que vous ne seriez plus en mesure de faire. Mais si vous n'aviez qu'à vous promener avec une minuscule queue de cochon, vous pourriez toujours courir, sauter et passer par les portes. GFP est comme le grosse queue – cela peut être un véritable obstacle à la fonction de nombreuses protéines. Mais ces petites étiquettes de liaison aux lanthanides sont presque invisibles. «
Pour démontrer l'utilisation des LBT pour l'imagerie des protéines en 3D avec une résolution à l'échelle nanométrique, les chercheurs du MIT et du BU ont marqué deux protéines dans une cellule bactérienne – une protéine cytoplasmique et une protéine membranaire. Ensuite, l'équipe de Miller a étudié l'échantillon sur la ligne de lumière de la nanosonde à rayons X durs (HXN) à NSLS-II et la ligne de lumière Bionanoprobe à la source de photons avancée (APS) – une installation utilisateur du DOE Office of Science au DOE's Argonne National Laboratory.
« HXN offre la taille de focalisation des rayons X la plus élevée au monde, qui descend à environ 12 nanomètres. Cela était essentiel pour l'imagerie de la cellule bactérienne en 3D avec une résolution à l'échelle nanométrique », a déclaré Yong Chu, scientifique principal de la ligne de lumière à HXN. « Nous avons également développé une nouvelle façon de monter les cellules sur un porte-échantillon spécialisé afin d'optimiser l'efficacité des mesures. »
En couplant la résolution inégalée de HXN avec les capacités des LBT, l'équipe a pu imager les deux protéines marquées. La visualisation de la protéine de la membrane cellulaire a prouvé que les LBT peuvent être vus à une haute résolution, tandis que l'imagerie de la protéine cytoplasmique a montré que les LBT pouvaient également être visualisés dans la cellule.
« À des concentrations élevées, les lanthanides sont toxiques pour les cellules », a déclaré Victor, « il était donc important pour nous de montrer que nous pouvions traiter les cellules avec une très faible concentration en lanthanides qui n'était pas toxique et suffisamment substantielle pour passer au-delà de la membrane cellulaire et de l'image. les protéines que nous voulions voir. «
Maintenant, avec cette nouvelle technique démontrée avec succès, les scientifiques espèrent pouvoir utiliser des LBT pour imager d'autres protéines dans la cellule à une résolution de 10 nanomètres.
La source:
DOE / Brookhaven National Laboratory
Référence de la revue:
Victor, T.W., et al. (2020) Étiquettes de liaison aux lanthanides pour l'imagerie 3D par rayons X des protéines dans les cellules à une résolution à l'échelle nanométrique. Journal de l'American Chemical Society. doi.org/10.1021/jacs.9b11571.
