Alors que la pandémie de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) continue d’infecter des centaines de milliers de personnes dans le monde, un nouveau papier pré-imprimé est apparu sur le bioRxiv* serveur décrit récemment un panel de nouveaux tests pour les ARNm génomiques (g) et sous-génomiques (sg) générés par le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2). La plupart des dosages actuellement utilisés sont soit qualitatifs, soit semi-quantitatifs, et ne peuvent pas évaluer les molécules de transcription en détail. Une cartographie détaillée des transcriptions virales pourrait aider à comprendre la réplication virale et l’évasion immunitaire.
Sommaire
Transcription dans le SRAS-CoV-2
Comme pour les autres coronavirus, le SRAS-CoV-2 a un modèle complexe de transcription, commençant par la production de molécules d’ARN de sens négatif, qui sont simplement les modèles sur lesquels l’ARNg de sens positif est synthétisé, ainsi que des molécules d’ARNsg produites par discontinu transcription. Une fois que le virus entre dans la cellule, l’ARNg est transcrit et traduit, donnant naissance à des protéines non structurales (Nsps) à partir des deux cadres de lecture ouverts, ORF1a et ORF1b. Cela se produit dans le complexe de réplication, dirigé par les séquences de régulation de la transcription (TRS), la protéine de nucléocapside (N) et les vésicules à double membrane (DMV), le tout dans le cytoplasme de la cellule hôte.
Au cours de ce processus, neuf sgRNA sont également formés à l’aide d’un commutateur de matrice pour alimenter une séquence de tête de ~ 70 nucléotides dans la région non traduite 5 ‘(UTR), terminée par un TRS court à l’extrémité 3’, à la séquence qui attend la transcription, sur l’un des gènes dans un tiers du génome à l’extrémité 3 ‘. La séquence leader TRS régule la transcription des sgRNA et peut permettre l’expression différentielle de certains gènes viraux.
Les séquences 5 ‘UTR peuvent coder pour la résistance au clivage médié par nsp1. Nsp1 peut inhiber l’expression du gène de l’hôte en favorisant la dégradation de l’ARNm de l’hôte. L’accumulation rapide de sgRNA dans la cellule hôte peut augmenter la gravité de la maladie. Pour les virus à ARN de sens positif, les sgRNA agissent comme régulateurs de la production de virions après la traduction des protéines virales, et facilitent également la traduction de la virulence ou des facteurs structurels.
Gènes ciblés dans l’étude actuelle
L’étude actuelle visait à cartographier divers gènes viraux exprimés dans des molécules génomiques ou sgRNA de manière quantitative, en utilisant un panel de sept dosages ddPCR. Les chercheurs ont sélectionné les gènes codant pour la principale protéase Nsp5, l’ARN polymérase ARN-dépendante (RdRp-Nsp12), quatre protéines majeures, à savoir la protéine de pointe (S), de membrane (M), d’enveloppe (E) et de nucléocapside (N), qui ont un rôle essentiel à jouer dans le SRAS-CoV-2. Pour le gène de la protéine de pointe, ils ont utilisé un ensemble d’amorces ciblant le court site de clivage polybasique (S-PBCS) qui est clivé en S1 et S2, le site qui est nouveau pour le SRAS-CoV-2 et qui peut améliorer son infectivité chez l’homme. .
Sensibilité et linéarité de la détection
L’utilisation de RT-ddPCR est supérieure à qRT-PCR en raison de sa quantifiabilité et de sa tolérance aux séquences de sonde / amorce inadaptées, ainsi que d’une précision plus élevée à de faibles nombres de copies, mais sans sacrifier la sensibilité ou la fiabilité. En fait, la sensibilité s’est avérée être jusqu’à 1 à 10 copies, avec une linéarité de plus de 3 à 4 ordres de grandeur.
Comparaison de l’efficacité et de la linéarité des tests publiés, du gène ORF1a «nCoV_IP2» et E et du nouveau test RDRP-NSP12. Les performances de notre test RDRP NSP12 ont été comparées aux amorces / sondes publiées pour ORF1a et le gène E dans la plate-forme ddPCR en utilisant des réactions RT courantes contenant des entrées d’ARN standard de virion de 2-2×104 copies / puits ddPCR. S (pente) et R2 sont indiqués pour chaque test.
De nombreux tests ont perdu leur sensibilité en raison de mutations qui affectent l’hybridation des amorces, ce qui indique la sensibilité de la détection lorsque plusieurs régions génomiques sont détectées simultanément, comme avec le panel actuel. Une sensibilité élevée, bien que non essentielle pour la détection de l’infection, sera probablement très utile pour révéler l’évolution de la maladie. On constate souvent que les dosages actuellement utilisés deviennent négatifs 2 à 3 semaines après l’infection, ou alternent entre positifs et négatifs à des moments successifs. Certaines personnes infectées continuent de subir une excrétion virale prolongée. Le test multi-cibles peut également révéler le profil transcriptionnel du virus.
En tant que tel, ce panel de tests peut être appliqué à une large gamme d’échantillons cliniquement pertinents dans lesquels l’ARN du SRAS-CoV-2 peut être en abondance faible ou élevée.
Nombre de copies plus élevé à 3 ‘UTR
Les régions génomiques à l’UTR 3 ‘avaient souvent des nombres de copies plus élevés par rapport à l’UTR 5’, peut-être en raison de l’efficacité accrue de la transcription inverse lorsque les dosages sont effectués à cette extrémité, peut-être en raison de la séquence poly-dT. Une autre explication est qu’à cette fin, ils détectent des sgRNA au sein de cellules infectées qui n’ont pas encore été conditionnées en particules virales. Ceux-ci pourraient avoir pénétré dans le surnageant à partir de cellules mourantes, ou peuvent être dans les exosomes à de faibles niveaux. Ainsi, les échantillons riches en cellules, ou ceux avec plus d’ARN associé aux cellules, peuvent avoir plus de cibles sgRNA, ce qui peut à nouveau affecter les tests cliniques et les résultats de la recherche.
L’ARN de fond améliore l’efficacité
Les tests actuels sont idéaux pour tester des échantillons provenant d’une variété de tissus avec des niveaux d’ARNg significativement différents, car, comme pour d’autres études, les chercheurs ont également constaté que les tests fonctionnaient mieux lorsque certains ARN de fond étaient présents. Cela est resté vrai même si l’efficacité du test était réduite lorsque la concentration d’ARN dépassait 100 ng / µL.
Comparabilité élevée entre RT-ddPCR et qRT-PCR
Les résultats obtenus par RT-ddPCR et qRT-PCR montrent tous deux une forte corrélation, tandis que la comparaison confirme également la capacité du premier à produire des données fiables même à faible nombre de copies.
Implications
Le panel contient ainsi des dosages quantitatifs sensibles pour l’ARN du SRAS-CoV-2 qui peuvent être utilisés pour cibler l’ensemble du génome, en détectant à la fois des gènes et des régions intergéniques, des protéines structurelles et non structurales et des gènes dans les sgRNA. Les implications de la transcription de sgRNA ne sont pas encore connues. Le panel de test actuel peut aider à comprendre comment le SRAS-CoV-2 détermine l’expression génique via des niveaux variables d’ARNg et d’ARNsg, et comment cela, à son tour, influence l’évolution de la maladie.
Ces tests peuvent servir de nouveaux outils moléculaires pour étudier l’infection par le SRAS-CoV-2, la dynamique de réplication et l’expression génique afin de mieux comprendre la dynamique virale et la pathogenèse du SRAS-CoV-2 au cours de l’infection.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
